A malatia d'Alzheimer (AD) ùn manca di biomarcatori di proteini chì riflettenu a so fisiopatologia sottostante multiple, chì impediscenu u prugressu di u diagnosticu è u trattamentu. Quì, usemu a proteomica cumpleta per identificà i biomarcatori di fluidu cerebrospinale (CSF) chì rapprisentanu una larga gamma di fisiopatologia AD. Spettrometria di massa multiplex hà identificatu circa 3.500 è circa 12.000 proteine in AD CSF è u cervellu, rispettivamente. L'analisi di a rete di u proteoma di u cervellu hà risoltu 44 moduli di biodiversità, 15 di i quali si sovrapponenu cù u proteoma di u fluidu cerebrospinale. I marcatori CSF AD in questi moduli sovrapposti sò piegati in cinque gruppi di proteini, chì rapprisentanu diversi prucessi fisiopatologichi. I sinapsi è i metaboliti in u cervellu AD diminuite, ma u CSF aumenta, mentri a mielinazione ricca di gliali è i gruppi immune in u cervellu è u CSF aumentanu. A cunsistenza è a specificità di a malatia di i cambiamenti di u pannellu sò stati cunfirmati in più di 500 mostre CSF supplementari. Questi gruppi anu identificatu ancu sottogruppi biologichi in AD asintomaticu. In generale, questi risultati sò un passu promettente versu l'arnesi di biomarcatori basati in web per l'applicazioni cliniche in AD.
A malatia d'Alzheimer (AD) hè a causa più cumuna di a demenza neurodegenerativa in u mondu sanu è hè carattarizata da una larga gamma di disfunzioni di u sistema biologicu, cumprese a trasmissione sinaptica, l'immunità mediata da gliali è u metabolismu mitocondriale (1-3). Tuttavia, i so biomarcatori di proteini stabiliti si concentranu sempre in a rilevazione di a proteina amiloide è tau, è per quessa ùn ponu micca riflette sta fisiopatologia diversa. Questi biomarcatori di proteini "core" chì sò più affidabili misurati in u fluidu cerebrospinal (CSF) includenu (i) beta peptide amiloide 1-42 (Aβ1-42), chì riflette a furmazione di plaques amiloide corticale; (ii) tau totale, un segno di degenerazione assonale; (iii) phospho-tau (p-tau), un rappresentante di l'iperfosforilazione patologica tau (4-7). Ancu s'è questi biomarcatori di u fluidu cerebrospinale anu facilitatu assai a nostra deteczione di e malatie di proteini AD "marcate" (4-7), rapprisentanu solu una piccula parte di a biologia cumplessa daretu à a malatia.
A mancanza di diversità fisiopatologia di i biomarcatori AD hà purtatu à parechje sfide, cumprese (i) l'incapacità di identificà è quantificà l'eterogeneità biologica di i pazienti AD, (ii) misurazione insufficiente di a gravità è a progressione di a malatia, in particulare in u stadiu preclinicu, è (ii) iii) u sviluppu di droghe terapèuti chì ùn anu micca risolviu cumplettamente tutti l'aspettu di u deterioramentu neurologicu. A nostra fiducia in a patologia di riferimentu per descriverà l'AD da e malatie cunnesse aggrava solu questi prublemi. Più è più evidenza mostranu chì a maiò parte di l'anziani cù dimenzja anu più di una caratteristica patologica di decadenza cognitiva (8). Quantu 90% o più di l'individui cù patologia AD anu ancu malatie vascular, inclusi TDP-43, o altre malatie degenerative (9). Queste proporzioni elevate di sovrapposizione patologica anu disturbatu u nostru quadru di diagnosticu attuale per a demenza, è hè necessaria una definizione fisiopatològica più cumpleta di a malatia.
In vista di a necessità urgente di una varietà di biomarcatori AD, u campu hè sempre più aduttatu u metudu "omics" basatu annantu à u sistema generale per scopre i biomarcatori. L'Alleanza Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD hè stata lanciata in 2014 è hè in prima linea di u prugramma. Stu sforzu multidisciplinariu da l'Istituti Naziunali di Salute, l'accademia è l'industria hà u scopu di utilizà strategie basate in u sistema per definisce megliu a fisiopatologia di AD è sviluppà analisi di diagnostica di biodiversità è strategie di trattamentu (10). Comu parte di stu prughjettu, a proteomica di a rete hè diventata un strumentu promettenti per l'avanzamentu di i biomarcatori basati in sistema in AD. Stu approcciu imparziale guidatu da dati urganizeghja insemi cumplessi di dati di proteomica in gruppi o "moduli" di proteine co-espresse chì sò assuciati cù tipi di cellule specifichi, organelli è funzioni biologiche (11-13). Quasi 12 studii di proteomica di rete ricca d'informazioni sò stati realizati nantu à u cervellu AD (13-23). In generale, queste analisi indicanu chì u proteoma di a rete di u cervellu AD mantene una urganizazione modulare altamente cunservata in cohorti indipendenti è parechje regioni corticali. Inoltre, alcuni di questi moduli mostranu cambiamenti riproducibili in l'abbundanza AD-related in i setti di dati, riflettendu a fisiopatologia di parechje malatie. In cullettivu, sti risultati dimustranu un puntu d'ancora promettente per a scuperta di u proteoma di a rete cerebrale cum'è un biomarcatore basatu in sistema in AD.
Per trasfurmà u proteoma di a rete cerebrale AD in biomarcatori clinicamente utili basati in u sistema, avemu cumminatu a rete derivata da u cervellu cù l'analisi proteomica di AD CSF. Stu approcciu integratu hà purtatu à l'identificazione di cinque setti promettenti di biomarcatori CSF chì sò assuciati cù una larga gamma di fisiopatologia basata nantu à u cervellu, cumprese sinapsi, vini sanguini, mielinizazione, inflammazioni è disfunzioni di e vie metaboliche. Avemu validatu cun successu questi pannelli di biomarcatori attraversu analisi di replicazione multiple, cumprese più di 500 campioni di CSF da diverse malatie neurodegenerative. Queste analisi di validazione includenu esaminà i miri di u gruppu in u CSF di i malati cù AD asintomaticu (AsymAD) o chì mostranu evidenza di accumulazione anormali di amiloide in un ambiente cognitivu normale. Queste analisi mette in risaltu l'eterogeneità biologica significativa in a pupulazione AsymAD è identificanu marcatori di pannelli chì ponu esse capace di subtipà l'individui in i primi stadi di a malatia. In generale, questi risultati rapprisentanu un passu chjave in u sviluppu di l'arnesi di biomarcatori di proteini basati nantu à parechji sistemi chì ponu risolve bè assai di e sfide cliniche affrontate da l'AD.
U scopu principale di stu studiu hè di identificà novi biomarcatori di u fluidu cerebrospinale chì riflettenu diverse fisiopatologia basata in u cervellu chì portanu à AD. A Figura S1 delinea a nostra metodulugia di ricerca, chì include (i) una analisi cumpleta guidata da i risultati preliminari di AD CSF è u proteoma cerebrale di a rete per identificà diversi biomarcatori di a malatia di CSF in relazione à u cervellu, è (ii) a replicazione successiva. coorti fluidi. A ricerca orientata à a scuperta hà iniziatu cù l'analisi di l'espressione differenziale di CSF in 20 individui cognitivamente normali è 20 pazienti AD in Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). U diagnosticu di AD hè definitu cum'è un deterioramentu cognitivu significativu in presenza di Aβ1-42 bassu è livelli elevati di tau totale è p-tau in u liquidu cerebrospinale [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA). )]] (Table S1A). U cuntrollu (media MoCA, 26.7 ± 2.2) hà avutu livelli normali di biomarcatori CSF.
U CSF umanu hè carattarizatu da una gamma dinamica di l'abbundanza di prutezione, in quale l'albumina è altre proteini estremamente abbundanti ponu impedisce a deteczione di proteine di interessu (24). Per aumentà a prufundità di a scuperta di a proteina, avemu eliminatu i primi 14 proteini assai abbundanti da ogni campione CSF prima di l'analisi di spettrometria di massa (MS) (24). Un totale di 39,805 peptidi sò stati identificati da MS, chì sò stati mappati à 3691 proteomi in 40 campioni. A quantificazione di a proteina hè realizata da l'etichettatura multiple tandem mass tag (TMT) (18, 25). Per risolve i dati mancanti, avemu inclusu solu quelli proteini chì sò stati quantificati in almenu 50% di i campioni in l'analisi sussegwente, cusì infine quantificà 2875 proteomi. A causa di a diferenza significativa in i livelli di l'abbundanza di a proteina tutale, una mostra di cuntrollu hè stata statisticamente cunsiderata un outlier (13) è ùn hè micca inclusu in l'analisi sussegwente. I valori di l'abbundanza di i 39 campioni rimanenti sò stati aghjustati secondu l'età, u sessu è a covarianza di batch (13-15, 17, 18, 20, 26).
Utilizendu l'analisi statistiche di t-test per evaluà l'espressione differenziale nantu à u settore di dati di regressione, questa analisi identificò proteini chì i livelli di abbundanza eranu cambiati significativamente (P <0.05) trà i casi di cuntrollu è AD (Table S2A). Comu mostra in a Figura 1A, l'abbundanza di un totale di 225 proteini in AD hè stata ridutta significativamente, è l'abbundanza di 303 proteini hè stata significativamente aumentata. Queste proteine differenzialmente espresse includenu parechji marcatori AD di fluidu cerebrospinale identificati prima, cum'è a proteina tau associata à i microtubuli (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protein 43 in relazione à a crescita. (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 like 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) è u fattore di crescita di u nervu VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Tuttavia, avemu ancu identificatu altri miri assai impurtanti, cum'è l'inibitore di dissociazione di GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) è SPARC-related calcium binding 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). L'analisi di Gene Ontology (GO) di 225 proteini ridotti significativamente hà revelatu una cunnessione stretta cù i prucessi di fluidi di u corpu, cum'è u metabolismu steroidu, a coagulazione di sangue è l'attività hormonale (Figura 1B è Table S2B). In cuntrastu, a proteina significativamente aumentata di 303 hè strettamente ligata à a struttura cellulare è u metabolismu energeticu.
(A) A trama di u vulcanu mostra u log2 fold change (x-axis) relative à u valore P statisticu -log10 (y-axis) ottenutu da u t-test, chì hè utilizatu per detectà l'espressione differenziale trà u cuntrollu (CT) è Casi AD di u proteoma CSF Di tutte e proteini. Prutiini cù livelli significativamente ridotti (P <0.05) in AD sò mostrati in blu, mentre chì i proteini cù livelli significativamente aumentati in a malatia sò indicati in rossu. A proteina scelta hè marcata. (B) I termini top GO ligati à a proteina sò significativamente ridotti (blu) è aumentati (rossu) in AD. Mostra i trè termini GO cù i più alti punteggi z in i campi di prucessi biologichi, funzioni moleculari è cumpunenti cellulari. (C) MS hà misuratu u nivellu di MAPT in u campione CSF (a sinistra) è a so correlazione cù u livellu ELISA tau di mostra (a destra). Le coefficient de correlation de Pearson avec la valeur P pertinente s'affiche. A causa di a mancanza di dati ELISA per un casu AD, sti figuri includenu valori per 38 di i 39 casi analizati. (D) L'analisi di cluster supervisata (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) aghjustatu P <0.01) nantu à u cuntrollu è AD CSF truvaru campioni utilizendu e proteine 65 più significativamente cambiate in u settore di dati. Standardizà, nurmalizà.
U nivellu proteomicu di MAPT hè strettamente ligatu à u livellu tau ELISA misuratu in modu indipendenti (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figura 1C), chì sustene a validità di a nostra misura MS. Dopu a digestione di tripsina à u livellu di a proteina di precursore amiloide (APP), i peptidi specifichi di l'isoforma mappati à l'estremità C di Aβ1-40 è Aβ1-42 ùn ponu micca ionizzati efficacemente (27, 28). Dunque, i peptidi APP chì avemu identificatu ùn anu nunda di fà cù i livelli ELISA Aβ1-42. Per evaluà l'espressione differenziale di ogni casu, avemu utilizatu proteine espresse differenziale cù P <0.0001 [tassa di scuperta falsa (FDR) corretta P <0.01] per realizà una analisi cluster supervisata di i campioni (Table S2A). Cum'è mostra in a Figura 1D, queste 65 proteini altamente significati ponu raggruppà currettamente campioni secondu u statu di a malatia, eccettu per un casu AD cù caratteristiche di cuntrollu. Di sti proteini 65, 63 anu aumentatu in AD, mentri solu dui (CD74 è ISLR) diminuinu. In totale, sti analisi di u fluidu cerebrospinale anu identificatu centinaie di proteini in AD chì ponu serve cum'è biomarcatori di malatie.
Dopu avemu realizatu una analisi di rete indipendente di u proteoma cerebrale AD. A cohorte di u cervellu di sta scuperta includeva a corteccia prefrontale dorsolaterale (DLPFC) da u cuntrollu (n = 10), a malatia di Parkinson (PD; n = 10), i casi AD / PD misti (n = 10) è AD (n = 10). ) Campione. Emery Goizueta ADRC. A demugrafia di sti casi 40 sò state descritte prima (25) è sò riassunte in Table S1B. Avemu usatu TMT-MS per analizà questi 40 tessuti cerebrali è a cohorte di replicazione di 27 casi. In totale, sti dui gruppi di dati di u cervellu pruducianu 227,121 peptidi unichi, chì sò stati mappati à 12,943 proteomi (25). Solu quelli proteini chì sò stati quantificati in almenu u 50% di i casi sò stati inclusi in investigazioni successive. U settore di dati di scuperta finali cuntene 8817 proteine quantificate. Aghjustate i livelli di abbundanza di proteine basatu nantu à l'età, u sessu è l'intervallu post-mortem (PMI). L'analisi di l'espressione differenziale di l'inseme di dati dopu a regressione hà dimustratu chì i livelli di proteina> 2000 anu cambiatu significativamente [P <0.05, analisi di varianza (ANOVA)] in dui o più cohorts di malatie. Dopu, avemu realizatu un analisi di cluster supervisatu basatu annantu à e proteine espresse differenziale, è P <0.0001 in paraguni AD / cuntrollu è / o AD / PD (Figura S2, A è B, Table S2C). Queste 165 proteini altamente alterate raffiguranu chjaramente i casi cù patologia AD da i campioni di cuntrollu è PD, cunfirmendu i forti cambiamenti specifichi di AD in tuttu u proteoma.
Dopu avemu utilizatu un algoritmu chjamatu Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) per realizà analisi di rete nantu à u proteoma cerebrale scupertu, chì urganizeghja a data set in moduli di proteina cù mudelli di espressione simili (11-13). L'analisi identificanu 44 moduli (M) proteine co-espresse, ordinate è numerate da u più grande (M1, n = 1821 proteins) à u più chjucu (M44, n = 34 proteins) (Figura 2A è Table S2D) ). Cumu l'esitatu sopra (13) Calculate u prufilu d'espressione rappresentativu o a proteina caratteristica di ogni modulu, è correlate cù u statu di a malatia è a patologia AD, vale à dì, stabilisce l'allianza di u Registru di a malatia di Alzheimer (CERAD) è u Score di Braak (Figura 2B). In generale, i moduli 17 eranu significativamente ligati à a neuropatologia AD (P <0.05). Parechji di sti moduli ligati à a malatia sò ancu ricchi in marcatori specifichi di u tipu di cellula (Figura 2B). Cumu l'esitatu sopra (13), l'arricchimentu di u tipu di cellula hè determinatu analizendu a sovrapposizione di moduli è a lista di riferimentu di geni specifichi di u tipu di cellula. Questi geni sò derivati da dati publicati in neuroni isolati di mouse, cellule endoteliali è gliali. Esperimentu di sequencing RNA (RNA-seq) (29).
(A) Scopre u WGCNA di u proteoma cerebrale. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) analisi di a proteina di signatura modulare (u primu cumpunente maiò di l'espressione di a proteina modulare) cù caratteristiche neuropatologiche AD (in cima), cumprese i punteggi CERAD (placca Aβ) è Braak (tau tangles). L'intensità di correlazioni pusitivi (rossi) è negativi (blu) sò indicati da una mappa di calore di dui culori, è l'asterischi indicanu significati statistichi (P <0.05). Aduprate Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (in fondu) per valutà l'associazione di u tipu di cellula di ogni modulu di proteina. L'intensità di l'ombra rossa indica u gradu di l'arricchimentu di u tipu di cellula, è l'asteriscu indica una significazione statistica (P <0,05). Aduprà u metudu BH per correggerà u valore P derivatu da u FET. (C) GO analisi di proteini modulari. I prucessi biologichi più strettamente ligati sò indicati per ogni modulu o gruppu di moduli rilativi. oligo, oligodendrocyte.
Un inseme di cinque moduli ricchi di astrociti è microglia strettamente ligati (M30, M29, M18, M24 è M5) dimustrava una forte correlazione positiva cù a neuropatologia AD (Figura 2B). L'analisi di l'ontologia liga sti moduli gliali cù a crescita cellulare, a proliferazione è l'immunità (Figura 2C è Table S2E). Dui moduli gliali supplementari, M8 è M22, sò ancu forti regulati in a malatia. M8 hè assai ligata à a via di u receptore Toll-like, una cascata di signalazione chì ghjoca un rolu chjave in a risposta immune innata (30). À u listessu tempu, M22 hè strettamente ligatu à a mudificazione post-traduzionale. M2, chì hè riccu in oligodendrociti, mostra una forte correlazione positiva cù a patologia AD è una cunnessione ontologica cù a sintesi di nucleosidi è a replicazione di l'ADN, chì indicanu una proliferazione cellulare rinfurzata in e malatie. In generale, questi risultati sustenenu l'elevazione di i moduli gliali chì avemu osservatu prima in u proteoma di a rete AD (13, 17). Attualmente si trova chì parechji moduli gliali ligati à l'AD in a reta mostranu livelli di espressione più bassi in casi di cuntrollu è PD, mettendu in risaltu a so specificità di a malatia chì hè elevata in AD (Figura S2C).
Solu quattru moduli in u nostru proteoma di rete (M1, M3, M10 è M32) sò fortemente correlati negativamente cù a patologia AD (P <0.05) (Figura 2, B è C). M1 è M3 sò ricchi di marcatori neuronali. M1 hè assai ligata à i signali sinaptici, mentri M3 hè strettamente ligatu à a funzione mitocondriale. Ùn ci hè micca evidenza di arricchimentu di u tipu di cellula per M10 è M32. M32 riflette a cunnessione trà M3 è u metabolismu cellulare, mentre chì M10 hè assai ligata à a crescita cellulare è a funzione di i microtubuli. Comparatu cù l'AD, tutti i quattru moduli sò aumentati in u cuntrollu è PD, dendu cambiamenti AD specifichi di a malatia (Figura S2C). In generale, questi risultati sustene l'abbundanza diminuita di moduli ricchi di neuroni chì avemu osservatu prima in AD (13, 17). In riassuntu, l'analisi di a rete di u proteoma cerebrale chì avemu scupertu hà pruduttu moduli alterati specificamente AD in cunfurmità cù i nostri scuperti precedenti.
L'AD hè carattarizata da un stadiu asintomaticu precoce (AsymAD), in quale l'individui mostranu l'accumulazione di amiloide senza decadenza cognitiva clinica (5, 31). Questa tappa asintomatica rapprisenta una finestra critica per a deteczione precoce è l'intervenzione. Avemu precedentemente dimustratu una forte preservazione modulare di u proteoma di a rete cerebrale AsymAD è AD in setti di dati indipendenti (13, 17). Per assicurà chì a reta di u cervellu chì avemu scupertu attualmente hè coherente cù questi risultati precedenti, avemu analizatu a preservazione di 44 moduli in u settore di dati replicati da 27 organizzazioni DLPFC. Queste urganisazione includenu casi di cuntrollu (n = 10), AsymAD (n = 8) è AD (n = 9). I campioni di cuntrollu è AD sò stati inclusi in l'analisi di a nostra cohorte cerebrale di scuperta (Table S1B), mentri i casi AsymAD eranu unichi solu in a cohorte di replicazione. Questi casi AsymAD venenu ancu da u bancu cerebrale Emory Goizueta ADRC. Ancu s'è a cugnizione era normale à u mumentu di a morte, i livelli amiloidi eranu anormalmente elevati (CERAD mediu, 2.8 ± 0.5) (Table S1B).
L'analisi TMT-MS di questi 27 tessuti cerebrali hà risultatu in a quantificazione di 11,244 proteomi. Stu cuntu finali include solu e proteine quantificate in almenu 50% di i campioni. Stu settore di dati replicatu cuntene 8638 (98,0%) di e 8817 proteine dettate in a nostra scuperta analisi di u cervellu, è hà quasi 3000 proteini cambiati significativamente trà i cohorts di cuntrollu è AD (P <0,05, dopu à u test t paired di Tukey per l'analisi di varianza) ( Table S2F). Trà queste proteini espressi in modu differenziale, 910 hà ancu dimustratu cambiamenti significativi di livellu trà AD è i casi di cuntrollu di proteoma cerebrale (P <0.05, dopu à ANOVA Tukey paired t-test). Hè da nutà chì questi marcatori 910 sò assai coerenti in a direzzione di u cambiamentu trà i proteomi (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figura S3A). Trà i proteini aumentati, i proteini cù i cambiamenti più consistenti trà i setti di dati sò principalmente membri di i moduli M5 è M18 ricchi di gliali (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 è GFAP). Trà i proteini ridotti, quelli cù i cambiamenti più consistenti eranu casi solu membri di u modulu M1 (NPTX2, VGF è RPH3A) assuciatu cù a sinapsi. Avemu verificatu ancu i cambiamenti in AD di midkine (MDK), CD44, secreted frizzled-related protein 1 (SFRP1) è VGF da Western Blotting (Figura S3B). L'analisi di preservazione di u modulu hà dimustratu chì circa 80% di i moduli di proteina (34/44) in u proteoma di u cervellu sò stati significativamente cunservati in u settore di dati di replicazione (z-score> 1.96, FDR corretta P <0.05) (Figura S3C). Quattordici di sti moduli sò stati apposta riservati trà i dui proteomi (z-score> 10, FDR corretta P <1.0 × 10-23). In generale, a scuperta è a replicazione di l'altu gradu di coerenza in l'espressione differenziale è a cumpusizioni modulari trà u proteoma cerebrale mette in risaltu a riproducibilità di i cambiamenti in a proteina di a corteccia frontale AD. Inoltre, hà ancu cunfirmatu chì AsymAD è e malatie più avanzate anu una struttura di rete di u cervellu assai simili.
Un analisi più detallatu di l'espressione differenziale in l'inseme di dati di replicazione cerebrale mette in risaltu u gradu significativu di cambiamenti di proteina AsymAD, cumprese un totale di 151 proteini significativamente cambiate trà AsymAD è u cuntrollu (P <0.05) (Figura S3D). In cunfurmità cù a carica amiloide, l'APP in u cervellu di AsymAD è AD anu aumentatu significativamente. MAPT cambia solu significativamente in AD, chì hè coherente cù i livelli aumentati di tangles è a so correlazione cunnisciuta cù a decadenza cognitiva (5, 7). I moduli ricchi di gliali (M5 è M18) sò assai riflessi in e proteine aumentate in AsymAD, mentre chì u modulu M1 neurone-related hè u più rappresentativu di e proteini diminuite in AsymAD. Parechji di questi marcatori AsymAD mostranu cambiamenti maiò in e malatie sintomatiche. Frà questi marcatori hè SMOC1, una proteina gliale appartenente à M18, chì hè assuciata à i tumori cerebrali è u sviluppu di l'ochji è di i membri (32). MDK hè un fattore di crescita di l'heparina ligatu à a crescita cellulare è l'angiogenesi (33), un altru membru di M18. Comparatu cù u gruppu di cuntrollu, AsymAD hà aumentatu significativamente, seguitu da un aumentu più grande di AD. In cuntrastu, a proteina sinaptica neuropentraxin 2 (NPTX2) hè stata significativamente ridotta in u cervellu AsymAD. NPTX2 era prima assuciatu cù a neurodegenerazione è hà un rolu ricunnisciutu in a mediazione di sinapsi excitatorie (34). In generale, questi risultati palesanu una varietà di cambiamenti di prutezione preclinica diffirenti in AD chì parevanu prugressi cù a gravità di a malatia.
Siccomu avemu ottinutu una prufundità significativa di a cobertura di prutezione in a scuperta di u proteoma di u cervellu, pruvemu di capiscenu più cumpletamente a so sovrapposizione cù u transcriptome AD à livellu di a rete. Dunque, avemu paragunatu u proteoma cerebrale chì avemu scupertu cù u modulu chì avemu generatu prima da a misurazione di microarray di 18,204 geni in AD (n = 308) è cuntrullà (n = 157) tessuti DLPFC (13). sovrapposizione. In totale, avemu identificatu 20 moduli di RNA differenti, assai di i quali dimustratu l'arricchimentu di tipi di cellule specifiche, cumprese neuroni, oligodendrociti, astrociti è microglia (Figura 3A). I cambiamenti multiplici di sti moduli in AD sò mostrati in Figura 3B. In cunfurmità cù a nostra precedente analisi di sovrapposizione di proteina-RNA utilizendu u proteoma MS senza etichettatura più profonda (circa 3000 proteini) (13), a maiò parte di i moduli 44 in a reta di proteoma cerebrale chì avemu trovu sò in a reta di transcriptome. a nostra scuperta è a replicazione di i moduli di proteine 34 chì sò assai ritenuti in u proteoma di u cervellu, solu 14 (~ 40%) anu passatu a prova esatta di Fisher (FET) hà dimustratu avè una superposizione statisticamente significativa cù u transcriptome (Figura 3A). Compatibile cù a riparazione di danni di DNA (P-M25 è P-M19), traduzzione di proteine (P-M7 è P-M20), RNA binding/splicing (P-M16 è P-M21) è targeting di proteine (P-M13 è P-). M23) ùn si sovrappone micca cù i moduli in u transcriptome. Dunque, anche se un inseme di dati di proteoma più profundo hè utilizatu in l'analisi di sovrapposizione attuale (13), a maiò parte di u proteoma di a rete AD ùn hè micca mappata à a reta di transcriptome.
(A) FET ipergeometricu dimostra l'arricchimentu di marcatori specifichi di u tipu di cellula in u modulu RNA di u transcriptome AD (in cima) è u gradu di sovrapposizione trà i moduli RNA (assi x) è proteini (assi y) di u cervellu AD. (in fondu). L'intensità di l'ombra rossa indica u gradu di arricchimentu di i tipi di cellula in u pannellu superiore è l'intensità di a superposizione di i moduli in u pannellu di fondu. L'asterischi indicanu significati statistichi (P <0,05). (B) U gradu di correlazione trà i geni caratteristici di ogni modulu di transcriptome è u statu AD. I moduli di a manca sò i più correlati negativamente cù AD (blu), è quelli di a diritta sò i più correlati positivamente cù AD (rossu). U valore P currettu BH-trasformatu in logu indica u gradu di significazione statistica di ogni correlazione. (C) Moduli sovrapposti significativi cù arricchimentu di tipu di cellula spartutu. (D) Analisi di correlazione di u cambiamentu di log2 volte di a proteina marcata (assi x) è RNA (assi y) in u modulu di sovrapposizione. Le coefficient de correlation de Pearson avec la valeur P pertinente s'affiche. Micro, microglia; corpi celesti, astrociti. CT, cuntrollu.
A maiò parte di i moduli di proteine è RNA sovrapposti sparte profili simili di arricchimentu di u tipu di cellula è direzzione di cambiamentu AD coherente (Figura 3, B è C). In altre parolle, u modulu M1 di sinapsi di u proteoma cerebrale (PM1) hè mappatu à trè moduli di RNA omologu ricchi di neuroni (R-M1, R-M9 è R-M16), chì sò in AD. un livellu ridottu. In listessu modu, i moduli di proteine M5 è M18 ricchi di glial si sovrapponenu cù i moduli di RNA ricchi di astrociti è marcatori microgliali (R-M3, R-M7, è R-M10) è sò assai implicati in e malatie Aumenta. Queste caratteristiche modulari spartute trà i dui setti di dati supportanu ancu l'arricchimentu di u tipu di cellula è i cambiamenti legati à e malatie chì avemu osservatu in u proteoma cerebrale. Tuttavia, avemu osservatu assai differenze significative trà i livelli di RNA è di prutezione di marcatori individuali in questi moduli cumuni. L'analisi di correlazione di l'espressione differenziale di a proteomica è a trascriptomica di e molécule in questi moduli sovrapposti (Figura 3D) mette in risaltu questa inconsistenza. Per esempiu, APP è parechje altre proteini di moduli gliali (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, è SFRP1) anu dimustratu un incrementu significativu in u proteoma AD, ma ùn ci era quasi nisun cambiamentu in u transcriptome AD. Questi cambiamenti specifichi di a proteina ponu esse strettamente ligati à e placche amiloidi (23, 35), chì mette in risaltu u proteoma cum'è a fonte di cambiamenti patologichi, è questi cambiamenti ùn ponu esse riflessi in u transcriptome.
Dopu avè analizatu indipindentamente i proteomi di u cervellu è di u CSF chì avemu scupertu, avemu realizatu un'analisi cumpleta di i dui gruppi di dati per identificà i biomarcatori AD CSF ligati à a fisiopatologia di a reta di u cervellu. Avemu prima di definisce a superposizione di i dui proteomi. Ancu s'ellu hè largamente accettatu chì u CSF riflette i cambiamenti neurochimici in u cervellu AD (4), u gradu esattu di sovrapposizione trà u cervellu AD è u proteoma CSF ùn hè micca chjaru. Paragunendu u nùmeru di prudutti di geni cumuni rilevati in i nostri dui proteomi, avemu trovu chì quasi u 70% (n = 1936) di e proteine identificate in u fluidu cerebrospinale sò stati quantificati ancu in u cervellu (Figura 4A). A maiò parte di sti proteini sovrapposti (n = 1721) sò mappati à unu di i 44 moduli di co-espressione da u set di dati di u cervellu di scuperta (Figura 4B). Cum'è previstu, i sei più grandi moduli cerebrali (M1 à M6) mostranu a più grande quantità di sovrapposizione di CSF. Tuttavia, ci sò moduli di u cervellu più chjuchi (per esempiu, M15 è M29) chì ghjunghjenu un inesperu altu gradu di sovrapposizione, più grande di un modulu cerebrale duie volte di a so dimensione. Questu ci motiva à aduttà un metudu più detallatu è statisticamente guidatu per calculà a sovrapposizione trà u cervellu è u fluidu cerebrospinale.
(A è B) I proteini rilevati in u cervellu di scuperta è i setti di dati CSF si sovrapponenu. A maiò parte di sti proteini sovrapposti sò assuciati cù unu di i 44 moduli di co-espressione di a rete di co-espressione cerebrale. (C) Scopre a sovrapposizione trà u proteoma di u fluidu cerebrospinale è u proteoma di a rete cerebrale. Ogni fila di a mappa di calore rapprisenta un analisi di sovrapposizione separata di u FET ipergeometricu. A fila superiore mostra a sovrapposizione (ombreggiatura grigia / nera) trà u modulu cerebrale è tuttu u proteoma CSF. A seconda linea mostra chì a sovrapposizione trà i moduli cerebrali è a proteina CSF (ombreggiata in rossu) hè significativamente regulata in AD (P <0.05). A terza fila mostra chì a sovrapposizione trà i moduli cerebrali è a proteina CSF (ombreggiatura blu) hè significativamente regulata in AD (P <0.05). Aduprà u metudu BH per correggerà u valore P derivatu da u FET. (D) Pannellu di moduli plegabile basatu annantu à l'associazione di u tipu di cellula è i termini GO cunnessi. Questi pannelli cuntenenu un totale di 271 proteini ligati à u cervellu, chì anu una espressione differenziale significativa in u proteoma CSF.
Aduprendu FET à coda unica, avemu valutatu l'impurtanza di a sovrapposizione di prutezione trà u proteoma CSF è moduli cerebrali individuali. L'analisi hà revelatu chì un totale di 14 moduli cerebrali in u settore di dati CSF anu sovrapposizioni statisticamente significative (FDR ajustatu P <0.05), è un modulu supplementu (M18) chì a so sovrapposizione hè vicinu à significatu (FDR ajustatu P = 0.06) (Figura 4C). , fila superiore). Semu ancu interessati à i moduli chì si sovrapponenu forte cù e proteine CSF espresse in modu differenziale. Dunque, avemu applicatu duie analisi FET supplementari per determinà quale di (i) a proteina CSF hè stata aumentata significativamente in AD è (ii) a proteina CSF hè stata significativamente diminuita in AD (P <0.05, t test AD / cuntrollu) Moduli cerebrali cun sovrapposizione significativa. trà elli. Cum'è mostra in a fila media è in fondu di a Figura 4C, queste analisi supplementari mostranu chì 8 di i 44 moduli cerebrali si sovrapponenu significativamente cù a proteina aghjuntu in AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, è M38) . ), mentri solu dui moduli (M6 è M15) anu dimustratu una superposizione significativa cù a proteina ridutta in AD CSF. Cum'è previstu, tutti i moduli 10 sò in i moduli 15 cù a più alta sovrapposizione cù u proteoma CSF. Dunque, assumemu chì questi moduli 15 sò fonti d'altu rendimentu di biomarcatori CSF derivati da l'AD.
Avemu piegatu questi 15 moduli sovrapposti in cinque grandi pannelli di proteine basatu nantu à a so vicinanza in u diagramma di l'arburu WGCNA è a so associazione cù i tipi di cellule è l'ontologia di geni (Figura 4D). U primu pannellu cuntene moduli ricchi di marcatori di neuroni è proteine in sinapsi (M1 è M12). U pannellu sinapticu cuntene un totale di 94 proteine, è i livelli in u proteoma CSF anu cambiatu significativamente, facendu a più grande fonte di marcatori CSF ligati à u cervellu trà i cinque pannelli. U sicondu gruppu (M6 è M15) hà dimustratu a stretta cunnessione cù i marcatori di e cellule endoteliali è u corpu vascular, cum'è "a guariscenza di ferite" (M6) è "regulazione di a risposta immune umorale" (M15). M15 hè ancu assai ligata à u metabolismu di lipoproteini, chì hè strettamente ligatu à l'endoteliu (36). U pannellu vascular cuntene 34 marcatori CSF ligati à u cervellu. U terzu gruppu include moduli (M2 è M4) chì sò significativamente ligati à i marcatori d'oligodendrocyte è a proliferazione cellulare. Per esempiu, i termini di l'ontologia di u primu livellu di M2 includenu "regulazione positiva di a replicazione di l'ADN" è "processu di biosintesi purina". Intantu, quelli di M4 includenu "diferenze di cellule gliali" è "segregazione di cromusomi". U pannellu di mielinizazione cuntene 49 marcatori CSF ligati à u cervellu.
U quartu gruppu cuntene a maiò parte di i moduli (M30, M29, M18, M24 è M5), è quasi tutti i moduli sò significativamente ricchi di microglia è marcatori d'astrocyte. Simile à u pannellu di mielinizazione, u quartu pannellu cuntene ancu moduli (M30, M29 è M18) chì sò strettamente ligati à a proliferazione cellulare. L'altri moduli in questu gruppu sò assai ligati à i termini immunologichi, cum'è "processu di effettu immune" (M5) è "regulazione di risposta immune" (M24). U gruppu immune glial cuntene 42 marcatori CSF ligati à u cervellu. Infine, l'ultimu pannellu include 52 marcatori ligati à u cervellu nantu à i quattru moduli (M44, M3, M33, è M38), chì sò tutti nantu à u corpu ligati à u almacenamiento di energia è u metabolismu. U più grande di sti moduli (M3) hè strettamente ligatu à a mitocondria è hè riccu in marcatori specifichi di neurone. M38 hè unu di i membri di i moduli più chjuchi in questu metaboloma è mostra ancu una specificità di neurone moderata.
In generale, questi cinque pannelli riflettenu una larga gamma di tipi di cellule è funzioni in a corteccia AD, è cuntenenu cullettivamente 271 marcatori CSF ligati à u cervellu (Table S2G). Per valutà a validità di questi risultati MS, avemu usatu l'assay di estensione di prossimità (PEA), una tecnulugia basata in anticorpi ortogonali cù capacità di multiplexing, alta sensibilità è specificità, è avemu rianalizzatu i campioni di fluidu cerebrospinale chì avemu trovu Un subset di questi 271 biomarcatori. (n = 36). Questi 36 miri dimustranu u cambiamentu in u multiplu AD di PEA, chì hè strettamente ligatu à i nostri risultati basati in MS (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), chì hà verificatu fermamente i risultati di a nostra analisi MS cumpleta (Figura S4). ).
I temi biologichi enfatizzati da i nostri cinque gruppi, da a signalazione sinaptica à u metabolismu energeticu, sò tutti ligati à a patogenesi di AD (1-3). Dunque, tutti i moduli 15 chì cuntenenu questi pannelli sò ligati à a patologia AD in u proteoma cerebrale chì avemu scupertu (Figura 2B). U più notu hè l'alta correlazione patologica positiva trà i nostri moduli gliali è a forte correlazione patologica negativa trà i nostri moduli neuronali più grandi (M1 è M3). L'analisi di espressione differenziale di u nostru proteoma cerebrale replicatu (Figura S3D) mette in risaltu ancu e proteine gliali derivate da M5 è M18. In l'AsymAD è l'AD sintomaticu, i proteini gliali più aumentati è sinapsi M1-related A proteina hè ridutta più. Queste osservazioni indicanu chì i 271 marcatori di fluidu cerebrospinal chì avemu identificatu in i cinque gruppi sò ligati à i prucessi di malatie in a corteccia AD, cumpresi quelli chì si trovanu in i primi stadi asintomatici.
Per analizà megliu a direzzione di u cambiamentu di e proteine di u pannellu in u cervellu è u fluidu spinali, avemu tracciatu i seguenti per ognunu di i 15 moduli sovrapposti: (i) truvate u livellu di abbundanza di moduli in u settore di dati di u cervellu è (ii) u modulu. proteina A diferenza hè spressione in u fluidu cerebrospinal (Figura S5). Cumu l'ammentatu prima, WGCNA hè utilizatu per determinà l'abbundanza di moduli o u valore di a proteina caratteristica in u cervellu (13). A mappa di u vulcanu hè utilizatu per discrìviri l'espressione differenziale di proteini modulari in u fluidu cerebrospinale (AD / cuntrollu). Queste figuri mostranu chì trè di i cinque pannelli mostranu tendenzi d'espressione diffirenti in u cervellu è u fluidu spinali. I dui moduli di u pannellu di sinapsi (M1 è M12) mostranu una diminuzione di u livellu di abbundanza in u cervellu AD, ma si sovrappone significativamente cù a proteina aumentata in l'AD CSF (Figura S5A). I moduli ligati à i neuroni chì cuntenenu u metaboloma (M3 è M38) dimustranu mudelli simili di espressione di u cervellu è di u fluidu cerebrospinale inconsistenti (Figura S5E). U pannellu vascular hà ancu dimustratu diverse tendenze di espressione, anche se i so moduli (M6 è M15) anu aumentatu moderatamente in u cervellu AD è diminuite in u CSF malatu (Figura S5B). I dui pannelli rimanenti cuntenenu grandi rete gliali chì e proteine sò regularmente regulate in i dui compartimenti (Figura S5, C è D).
Per piacè nutate chì sti tendenzi ùn sò micca cumuni à tutti i marcatori in questi pannelli. Per esempiu, u pannellu sinapticu include parechje proteini chì sò significativamente ridotti in u cervellu AD è CSF (Figura S5A). Frà questi marcatori di fluidu cerebrospinale regulati in regula sò NPTX2 è VGF di M1, è a cromogranina B di M12. Tuttavia, malgradu queste eccezzioni, a maiò parte di i nostri marcatori sinaptici sò elevati in u fluidu spinali AD. In generale, sti analisi sò stati capaci di distingue tendenzi statisticamente significativi in i livelli di u cervellu è di u fluidu cerebrospinale in ognuna di i nostri cinque pannelli. Queste tendenze mette in risaltu a relazione cumplessa è spessu diversa trà l'espressione di a proteina di u cervellu è u CSF in AD.
Dopu, avemu utilizatu l'analisi di replicazione MS high-throughput (replicazione CSF 1) per restringe u nostru set 271 di biomarcatori à i miri più promettenti è riproducibili (Figura 5A). A copia CSF 1 cuntene un totale di 96 campioni da Emory Goizueta ADRC, cumpresu cuntrollu, AsymAD è cohorte AD (Table S1A). Questi casi AD sò carattarizati da una decadenza cognitiva ligera (MoCA media, 20.0 ± 3.8), è cambiamenti in i biomarcatori AD cunfirmati in u fluidu cerebrospinal (Table S1A). A cuntrariu di l'analisi CSF chì avemu trovu, sta replicazione hè realizata utilizendu un metudu MS "single-shot" più efficiente è d'alta produzzione (senza fraccionamentu off-line), cumpresu un protokollu simplificatu di preparazione di mostra chì elimina a necessità di immunodepletion di campioni individuali. . Invece, un unicu "canale di rinfurzà" immune-depleted hè utilizatu per amplificà u signale di proteini menu abbundanti (37). Ancu s'ellu riduce a copertura tutale di proteoma, stu metudu di un colpu unicu riduce significativamente u tempu di a macchina è aumenta u numeru di campioni marcati da TMT chì ponu esse analizzati viabili (17, 38). In totale, l'analisi hà identificatu 6,487 peptidi, chì anu mappatu à 1,183 proteomi in 96 casi. Cum'è cù l'analisi CSF chì avemu trovu, solu quelli proteini quantificati in almenu 50% di i campioni sò stati inclusi in i calculi sussegwenti, è a data hè stata regressa per l'effetti di età è genere. Questu hà purtatu à a quantificazione finali di 792 proteomi, u 95% di i quali eranu ancu identificati in u settore di dati CSF trovu.
(A) Obiettivi di proteina CSF legati à u cervellu verificati in a prima cohorte CSF replicata è inclusi in u pannellu finali (n = 60). (B à E) Livelli di biomarcatori di pannelli (punteggi z composti) misurati in quattru cohorti di replicazione CSF. T-testi accoppiati o ANOVA cù a post-correzione di Tukey sò stati utilizati per evaluà a significazione statistica di i cambiamenti in abbundanza in ogni analisi replicate. CT, cuntrollu.
Siccomu simu particularmente interessatu à verificà i nostri 271 obiettivi di CSF legati à u cervellu per mezu di un'analisi cumpleta, limiteremu più esaminazione di stu proteoma replicatu à questi marcatori. Frà queste 271 proteini, 100 sò stati rilevati in a replicazione CSF 1. A figura S6A mostra l'espressione differenziale di questi marcatori 100 sovrapposti trà i campioni di replicazione di cuntrollu è AD. L'histoni sinaptici è metaboliti aumentanu u più in AD, mentre chì i proteini vascular diminuinu più in a malatia. A maiò parte di i 100 marcatori sovrapposti (n = 70) mantenenu a listessa direzzione di cambiamentu in i dui setti di dati (Figura S6B). Questi 70 marcatori validati di CSF ligati à u cervellu (Table S2H) riflettenu largamente i tendenzi di l'espressione di u pannellu osservati prima, vale à dì, a regulazione di e proteine vascolari è a regulazione di tutti l'altri pannelli. Solu 10 di questi 70 proteini validati anu dimustratu cambiamenti in l'abbundanza AD chì cuntradite sti tendenzi di u panel. Per generà un pannellu chì riflette megliu a tendenza generale di u cervellu è u fluidu cerebrospinale, avemu escluditu queste 10 proteini da u pannellu d'interessu chì avemu verificatu infine (Figura 5A). Dunque, u nostru pannellu include infine un totale di 60 proteine verificate in duie coorti CSF AD indipendenti chì utilizanu diverse preparazione di campioni è analisi di piattaforma MS. L'espressione z-score di questi pannelli finali in u cuntrollu di a copia CSF 1 è i casi AD cunfirmanu a tendenza di u pannellu osservata in a cohorte CSF chì avemu trovu (Figura 5B).
Trà questi 60 proteini, ci sò moleculi cunnisciuti per esse assuciati cù l'AD, cum'è l'osteopontina (SPP1), chì hè una citochina proinflamatoria chì hè stata assuciata à l'AD in parechji studii (39-41), è GAP43, A proteina sinaptica. chì hè chjaramente ligata à a neurodegenerazione (42). E proteine più verificate sò marcatori ligati à altre malatie neurodegenerative, cum'è l'esclerosi laterale amiotrofica (ALS) superoxide dismutase 1 (SOD1) è a desaccharase ligata à a malatia di Parkinson (PARK7). Avemu ancu verificatu chì parechji altri marcatori, cum'è SMOC1 è a proteina 1 di segnalazione di l'attaccamentu di a membrana ricca in u cervellu (BASP1), anu limitatu ligami precedenti à a neurodegenerazione. Vale a pena nutà chì, per via di a so abbundanza generale bassa in u proteoma CSF, hè difficiule per noi di utilizà stu metudu di rilevazione di un colpu unicu high-throughput per detectà in modu affidabile MAPT è certe altre proteine relatate à AD (per esempiu, NEFL è NRGN). ) ( 43, 44).
Dopu avemu verificatu questi 60 marcatori di pannelli di priorità in trè analisi replicate supplementari. In CSF Copy 2, avemu usatu un unicu TMT-MS per analizà una cohorte indipendente di 297 controlli è campioni AD da Emory Goizueta ADRC (17). A replicazione CSF 3 includeu una reanalisi di e dati TMT-MS dispunibili da 120 cuntrolli è pazienti AD da Lausanne, Svizzera (45). Avemu rilevatu più di dui terzi di i marcatori di priorità 60 in ogni dataset. Ancu l'studiu svizzero hà utilizatu diverse plataformi MS è metudi di quantificazione TMT (45, 46), avemu ripruduciutu fermamente i nostri tendenzi di u panel in dui analisi ripetuti (Figura 5, C è D, è Tables S2, I è J). Per evaluà a specificità di a malatia di u nostru gruppu, avemu usatu TMT-MS per analizà u quartu settore di dati di replicazione (replicazione CSF 4), chì includenu micca solu casi di cuntrollu (n = 18) è AD (n = 17), ma ancu PD ( n = 14)), ALS (n = 18) è campioni di demenza frontotemporale (FTD) (n = 11) (Table S1A). Avemu quantificatu cun successu quasi dui terzi di e proteine di pannellu in questa cohorte (38 fora di 60). Questi risultati evidenzianu i cambiamenti specifichi AD in tutti i cinque pannelli di biomarcatori (Figura 5E è Table S2K). L'aumentu di u gruppu di metabolite hà dimustratu a più forte specificità AD, seguita da u gruppu di mielinizazione è glial. In una misura minore, FTD mostra ancu un aumentu trà questi pannelli, chì ponu riflette cambiamenti di rete potenziali simili (17). In cuntrastu, ALS è PD dimustravanu quasi i stessi profili di mielinizazione, glial è metaboloma cum'è u gruppu di cuntrollu. In generale, malgradu e differenze in a preparazione di campioni, a piattaforma MS è i metudi di quantificazione TMT, queste analisi ripetute mostranu chì i nostri marcatori di u pannellu di priorità anu cambiamenti specifichi AD altamente consistenti in più di 500 campioni CSF unichi.
A neurodegenerazione AD hè stata largamente ricunnisciuta parechji anni prima di l'iniziu di i sintomi cognittivi, per quessa, ci hè una necessità urgente di biomarcatori di AsymAD (5, 31). In ogni casu, più è più evidenza mostranu chì a biologia di AsymAD hè luntanu da l'omogenea, è l'interazzione cumplessa di risicu è resilienza porta à grandi differenze individuali in a progressione di a malatia (47). Ancu s'ellu hè stata utilizata per identificà i casi AsymAD, i livelli di i biomarcatori di u core CSF (Aβ1-42, tau totale è p-tau) ùn anu micca pruvatu à pudè predichendu in modu affidabile quale prugressu à a demenza (4, 7), chì indicanu più Puderia esse. Hè necessariu include strumenti biomarcatori olistici basati nantu à parechji aspetti di a fisiologia cerebrale per stratificà accuratamente u risicu di sta populazione. Per quessa, dopu avemu analizatu u nostru pannellu di biomarcatori validati da AD in a pupulazione AsymAD di copia CSF 1. Questi casi 31 AsymAD mostranu livelli di biomarcatori core anormali (Aβ1-42 / ratio ELISA tau totale, <5.5) è a cognizione cumpleta (mean MoCA, 27.1). ± 2,2) (Table S1A). Inoltre, tutti l'individui cù AsymAD anu un puntu di demenza clinica di 0, chì indicanu chì ùn ci hè micca evidenza di una diminuzione di u rendiment cognitivu o funziunale di ogni ghjornu.
Avemu prima analizatu i livelli di i pannelli validati in tutti i 96 CSF replicati 1, cumprese a cohorte AsymAD. Avemu trovu chì parechji pannelli in u gruppu AsymAD avianu cambiamenti significativi di abbundanza cum'è AD, u pannellu vascular dimustrava una tendenza discendente in AsymAD, mentre chì tutti l'altri pannelli mostranu una tendenza ascendente (Figura 6A). Dunque, tutti i pannelli mostranu una correlazione altamente significativa cù ELISA Aβ1-42 è i livelli totali di tau (Figura 6B). In cuntrastu, a correlazione trà u gruppu è u puntu MoCA hè relativamente povera. Unu di i risultati più impressiunanti da queste analisi hè a larga gamma di abbundanza di pannelli in a cohorte AsymAD. Comu mostra in a Figura 6A, u nivellu di u pannellu di u gruppu AsymAD di solitu attraversa u livellu di u pannellu di u gruppu di cuntrollu è u gruppu AD, chì mostra una variabilità relativamente alta. Per scopre ulteriormente questa eterogeneità di AsymAD, avemu applicatu l'analisi di Scaling Multidimensionale (MDS) à 96 casi di replicazione CSF 1. L'analisi MDS permette di visualizà a similarità trà i casi basati nantu à certe variàbili in u settore di dati. Per questa analisi di cluster, usemu solu quelli marcatori di pannelli validati chì anu un cambiamentu statisticamente significativu (P <0.05, AD / cuntrollu) in u nivellu di scuperta CSF è replicazione 1 proteoma (n = 29) (Table S2L). Questa analisi hà pruduttu un clustering spaziale chjaru trà i nostri casi di cuntrollu è AD (Figura 6C). In cuntrastu, certi casi AsymAD sò chjaramente raggruppati in u gruppu di cuntrollu, mentri àutri si trovanu in casi AD. Per scopre ulteriormente questa eterogeneità AsymAD, avemu usatu a nostra mappa MDS per definisce dui gruppi di questi casi AsymAD. U primu gruppu includeva i casi AsymAD raggruppati più vicinu à u cuntrollu (n = 19), mentri u sicondu gruppu era carattarizatu da i casi AsymAD cun un prufilu di marcatore più vicinu à l'AD (n = 12).
(A) U livellu di espressione (z-score) di u gruppu di biomarcatori CSF in tutti i 96 campioni in a cohorte di replicazione CSF 1, cumpresu AsymAD. L'analisi di varianza cù a post-correzione di Tukey hè stata utilizata per evaluà a significazione statistica di i cambiamenti di l'abbundanza di u pannellu. (B) Analisi di correlazione di u nivellu di abbundanza di proteine di pannellu (z-score) cù u puntu MoCA è u nivellu tau tutale in campioni ELISA Aβ1-42 è CSF copia 1. Le coefficient de correlation de Pearson avec la valeur P pertinente s'affiche. (C) U MDS di 96 CSF copia 1 casi era basatu annantu à i livelli di abbundanza di 29 marcatori di pannellu validati, chì sò stati significativamente cambiati in a scuperta è in CSF copy 1 data sets [P <0.05 AD/control (CT)]. Questa analisi hè stata utilizata per dividisce u gruppu AsymAD in sottogruppi di cuntrollu (n = 19) è AD (n = 12). (D) A trama di u vulcanu mostra l'espressione differenziale di tutte e proteine 1 di replicazione CSF cù log2 fold change (x-axis) relative à u valore P statisticu -log10 trà i dui sottogruppi AsymAD. I biomarcatori di u pannellu sò culurati. (E) A replicazione di CSF 1 u livellu di abbundanza di i biomarcatori di u gruppu di selezzione sò espressi in modu sfarente trà i sottogruppi AsymAD. L'analisi post-aggiustata di a varianza di Tukey hè stata utilizata per evaluà a significazione statistica.
Avemu esaminatu l'espressione di prutezione differenziale trà questi casi di cuntrollu è AD-like AsymAD (Figura 6D è Table S2L). A mappa di u vulcanu risultatu mostra chì 14 marcatori di pannelli anu cambiatu significativamente trà i dui gruppi. A maiò parte di sti marcatori sò membri di a sinapsi è u metaboloma. Tuttavia, SOD1 è myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), chì sò membri di i gruppi immune myelin è glial, rispettivamente, appartenenu ancu à stu gruppu (Figura 6, D è E). U pannellu vascular hà ancu cuntribuitu à dui marcatori chì sò stati significativamente ridotti in u gruppu AsymAD simili à AD, cumprese a proteina di legame AE 1 (AEBP1) è u membru di a famiglia di cumplementari C9. Ùn ci era micca una differenza significativa trà i sottogruppi AsymAD di cuntrollu è AD-like in ELISA AB1-42 (P = 0.38) è p-tau (P = 0.28), ma ci era veramente una differenza significativa in u livellu tau tutale (P = 0.0031). ) (Fig. S7). Ci sò parechji marcatori di pannellu chì indicanu chì i cambiamenti trà i dui sottogruppi AsymAD sò più significati chì i livelli totali di tau (per esempiu, YWHAZ, SOD1 è MDH1) (Figura 6E). In generale, questi risultati indicanu chì u nostru pannellu validatu pò cuntene biomarcatori chì ponu subtipà è stratificazione di risicu potenziale di i malati cù a malatia asintomatica.
Ci hè una necessità urgente di strumenti di biomarcatori basati in u sistema per misurà megliu è indirizzà e diverse fisiopatologia daretu à l'AD. Questi strumenti sò previsti micca solu di cambià u nostru quadru di diagnosticu AD, ma ancu di prumove l'adopzione di strategie di trattamentu efficaci, specifichi per i pazienti (1, 2). Per questu scopu, avemu applicatu un approcciu di proteomica cumpleta imparziale à u cervellu di l'AD è u CSF per identificà i biomarcatori CSF basati in u web chì riflettenu una larga gamma di fisiopatologia basata in u cervellu. A nostra analisi hà pruduttu cinque pannelli di biomarcatori CSF, chì (i) riflettenu sinapsi, vini sanguini, mielina, disfunzione immune è metabolica; (ii) dimustrà una forte riproducibilità in diverse piattaforme MS; (iii) Mostra cambiamenti progressivi specifichi di a malatia in tuttu u stadiu iniziale è tardu di l'AD. In generale, questi risultati rapprisentanu un passu promettente versu u sviluppu di strumenti di biomarcatori diversi, affidabili è orientati à u web per a ricerca AD è l'applicazioni cliniche.
I nostri risultati dimustranu l'urganizazione altamente cunservata di u proteoma di a rete di u cervellu AD è sustene u so usu cum'è ancora per u sviluppu di biomarcatori basatu in u sistema. A nostra analisi mostra chì dui set di dati TMT-MS indipendenti chì cuntenenu i cervelli AD è AsymAD anu una forte modularità. Questi risultati estendenu u nostru travagliu precedente, dimustrendu a preservazione di i moduli putenti di più di 2 000 tessuti cerebrali da parechje cohorti indipendenti in a corteccia frontale, parietale è temporale (17). Questa rete di cunsensu riflette diversi cambiamenti di malatie osservati in a ricerca attuale, cumprese l'aumentu di i moduli inflammatorii ricchi di gliali è a diminuzione di i moduli ricchi di neuroni. Cum'è a ricerca attuale, sta rete à grande scala presenta ancu cambiamenti modulari significativi in AsymAD, chì mostra una varietà di diverse fisiopatologia preclinica (17).
In ogni casu, in questu quadru basatu in u sistema altamente cunservatore, ci hè più eterogeneità biologica fine, in particulare trà l'individui in i primi stadi di AD. U nostru pannellu di biomarcatori hè capaci di rapprisenta dui sottogruppi in AsymAD, chì dimostranu l'espressione differenziale significativa di più marcatori CSF. U nostru gruppu hà sappiutu mette in risaltu e differenze biologiche trà sti dui sottogruppi, chì ùn eranu micca evidenti à u livellu di i biomarcatori AD core. Comparatu cù u gruppu di cuntrollu, i rapporti Aβ1-42 / tau totale di questi individui AsymAD eranu anormalmente bassu. Tuttavia, solu i livelli totali di tau eranu significativamente diffirenti trà i dui sottogruppi AsymAD, mentre chì i livelli Aβ1-42 è p-tau sò stati relativamente paragunabili. Siccomu l'altu CSF tau pare esse un megliu predittore di i sintomi cognittivi cà i livelli Aβ1-42 (7), suspettemu chì e duie cohorts AsymAD ponu avè risichi diffirenti di progressione di a malatia. Data a dimensione limitata di mostra di u nostru AsymAD è a mancanza di dati longitudinali, più ricerca hè necessaria per piglià cun fiducia queste cunclusioni. Tuttavia, questi risultati indicanu chì un pannellu CSF basatu in u sistema pò rinfurzà a nostra capacità di stratificà efficacemente l'individui durante a fase asintomatica di a malatia.
In generale, i nostri scuperti sustenenu u rolu di parechje funzioni biologiche in a patogenesi di AD. Tuttavia, u metabolismu energeticu disregulatu hè diventatu u tema prominente di tutti i nostri cinque pannelli di etichettatura validati. E proteine metaboliche, cum'è l'ipoxantina-guanine fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1) è a lactate dehydrogenase A (LDHA), sò i biomarcatori sinaptici più robusti validati, chì indicanu chì l'aumentu di AD CSF hè un sessu altamente riproducibile. I nostri vini sanguini è i pannelli gliali cuntenenu ancu parechji marcatori implicati in u metabolismu di sustanzi oxidative. Sti scuperti sò cunsistenti cù u rolu chjave chì i prucessi metabolichi ghjucanu in tuttu u cervellu, micca solu per risponde à l'alta dumanda d'energia di i neuroni, ma ancu per risponde à l'alta dumanda d'energia di l'astrociti è altre cellule gliali (17, 48). I nostri risultati sustenenu l'evidenza crescente chì i cambiamenti in u potenziale redox è l'interruzzione di i percorsi energetichi ponu esse u ligame core trà parechji prucessi chjave implicati in a patogenesi di l'AD, cumpresi i disordini mitocondriali, l'infiammazione mediata da gliali è i danni vascular (49). Inoltre, i biomarcatori di u fluidu cerebrospinale metabolicu cuntenenu un gran numaru di proteine differenzialmente ricche trà u nostru cuntrollu è i sottogruppi AsymAD simili à AD, chì suggerenu chì a disrupzione di sti percorsi di energia è redox pò esse critica in u stadiu preclinicu di a malatia.
E diverse tendenze di u pannellu di u cervellu è di u fluidu cerebrospinale chì avemu osservatu anu ancu implicazioni biologiche interessanti. Sinapsi è metabolomi ricchi di neuroni mostranu livelli diminuiti in u cervellu AD è abbundanza aumentata in u fluidu cerebrospinale. Siccomu i neuroni sò ricchi di mitocondri chì producenu energia in sinapsi per furnisce l'energia per i so numerosi signali specializati (50), a similitudine di i profili di espressione di sti dui gruppi di neuroni hè prevista. A perdita di neuroni è l'estrusione di e cellule danate ponu spiegà sti tendenzi di u pannellu di u cervellu è di u CSF in a malatia più tardi, ma ùn ponu micca spiegà i primi cambiamenti di u pannellu chì avemu osservatu (13). Una spiegazione pussibule per questi risultati in a malatia asintomatica iniziale hè a poda sinaptica anormale. A nova evidenza in mudelli di mouse suggerisce chì a fagocitosi sinaptica mediata da microglia pò esse attivata anormalmente in AD è porta à a perdita di sinapsi precoce in u cervellu (51). Stu materiale sinapticu scartatu pò accumulà in CSF, per quessa avemu osservatu l'aumentu di CSF in u pannellu di neurone. A poda sinaptica mediata da l'immunità pò ancu spiegà parzialmente l'aumentu di e proteine gliali chì avemu osservatu in u cervellu è u fluidu cerebrospinale in tuttu u prucessu di a malatia. In più di a poda sinaptica, l'anormalità generale in a via esocitica pò ancu purtà à diverse espressioni cerebrali è CSF di marcatori neuronali. Una quantità di studii anu dimustratu chì u cuntenutu di l'esosomi in a patogenesi di u cervellu AD hà cambiatu (52). A via extracellulare hè ancu implicata in a proliferazione di Aβ (53, 54). Vale a pena nutà chì a suppressione di a secrezione esosomale pò riduce a patologia simile à l'AD in mudelli di mouse transgenici AD (55).
À u listessu tempu, a proteina in u pannellu vascular hà dimustratu un aumentu moderatu di u cervellu AD, ma significativamente diminuite in u CSF. A disfunzione di a barriera sangue-cervellu (BBB) pò spiegà in parte questi risultati. Parechji studii umani post mortem indipendenti anu dimustratu a rottura di BBB in AD (56, 57). Questi studii anu cunfirmatu diverse attività anormali chì circundanu sta strata strettamente sigillata di cellule endoteliali, cumprese a fuga di capillari cerebrali è l'accumulazione perivascular di proteine di sangue (57). Questu pò furnisce una spiegazione simplice per e proteini vascular elevati in u cervellu, ma ùn pò micca spiegà cumplettamente l'esaurimentu di sti stessi proteini in u fluidu cerebrospinal. Una pussibilità hè chì u sistema nervu cintrali hè attivamente isolatu queste molécule per risolve u prublema di l'infiammazione aumentata è u stress oxidativu. A riduzzione di alcune di e proteini CSF più severi in questu pannellu, in particulare quelli implicati in a regulazione di lipoproteini, hè ligata à l'inhibizione di livelli dannosi di inflammazioni è u prucessu neuroprotettivu di e spezie di l'ossigenu reattivu. Questu hè veru per a Paroxonase 1 (PON1), una enzima di lipoproteina rispunsevuli di riduce i livelli di stress oxidativu in a circulazione (58, 59). U precursore Alpha-1-microglobulina / bikunin (AMBP) hè un altru marcatu significativamente regulatu di u gruppu vascular. Hè u precursore di u trasportatore di lipidi bikunin, chì hè ancu implicatu in a suppressione di a inflamazioni è a Proteczione neurologica (60, 61).
Malgradu diverse ipotesi interessanti, l'incapacità di detectà direttamente i miccanismi di e malatie biochimiche hè una limitazione ben cunnisciuta di l'analisi proteomica guidata da a scuperta. Dunque, più ricerca hè necessaria per definisce cun fiducia i miccanismi daretu à questi pannelli biomarcatori. Per avvià versu u sviluppu di l'analisi clinica basata in MS, a direzzione futura richiede ancu l'usu di metudi quantitativi mirati per a verificazione di biomarcatori à grande scala, cum'è u monitoraghju di reazione selettivu o parallelu (62). Recentemente avemu usatu u monitoraghju di reazione parallela (63) per cunvalidà parechji di i cambiamenti di a proteina CSF descritti quì. Diversi obiettivi di pannellu di priorità sò quantificati cù una precisione significativa, cumprese YWHAZ, ALDOA, è SMOC1, chì mappanu à i nostri pannelli sinapsi, metabolismu è inflammazione, rispettivamente (63). L'Acquisizione di Dati Indipendente (DIA) è altre strategie basate in MS ponu ancu esse utili per a verificazione di destinazione. Bud et al. (64) Hè statu dimustratu recentemente chì ci hè una sovrapposizione significativa trà i biomarcatori AD identificati in u nostru set di dati di scuperta CSF è u set di dati indipendenti DIA-MS, chì hè custituitu da quasi 200 campioni CSF da trè cohorti europee differenti. Questi studii recenti sustenenu u putenziale di i nostri pannelli per trasfurmà in una rilevazione affidabile basata in MS. A rilevazione tradiziunale di l'anticorpi è l'aptameri hè ancu impurtante per u sviluppu di i biomarcatori chjave AD. A causa di a bassa abbundanza di CSF, hè più difficiuli di detectà questi biomarcatori utilizendu metudi MS à altu rendiment. NEFL è NRGN sò dui esempii di biomarcatori CSF di bassa abbundanza, chì sò mappati à u pannellu in a nostra analisi cumpleta, ma ùn ponu micca esse rilevati in modu affidabile utilizendu a nostra strategia MS unica. Strategii di targeting basati nantu à parechji anticorpi, cum'è PEA, ponu prumove a trasfurmazioni clinica di questi marcatori.
In generale, stu studiu furnisce un approcciu proteomicu unicu per l'identificazione è a verificazione di biomarcatori CSF AD basati nantu à diversi sistemi. L'ottimisazione di questi pannelli di marcatori in e cohorti AD supplementari è e piattaforme MS pò esse promettenti per avanzà a stratificazione è u trattamentu di u risicu di l'AD. I studii chì valutanu u livellu longitudinale di questi pannelli cù u tempu sò ancu critichi per determinà quale cumminazione di marcatori stratifica u risicu di a malatia precoce è i cambiamenti in a gravità di a malatia.
Eccettu per i campioni 3 copiati da CSF, tutti i campioni CSF usati in stu studiu sò stati cullati sottu l'auspici di Emory ADRC o istituzioni di ricerca strettamente ligati. Un totale di quattru setti di campioni di Emory CSF sò stati utilizati in questi studii di proteomica. A cohorte CSF hè stata trovata per cuntene campioni da 20 cuntrolli sani è 20 pazienti AD. A copia CSF 1 include campioni da 32 cuntrolli sani, 31 individui AsymAD è 33 individui AD. A copia CSF 2 cuntene 147 cuntrolli è 150 campioni AD. A cohorte di replicazione CSF multi-malattia 4 includeva 18 cuntrolli, 17 AD, 19 ALS, 13 PD è 11 FTD. Sicondu l'accordu appruvatu da u Cunsigliu di Revisione Istituzionale di l'Università Emory, tutti i participanti di u studiu Emory anu uttenutu cunsensu infurmatu. Sicondu u 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), u fluidu cerebrospinale hè statu cullucatu è almacenatu da puntura lumbar. I pazienti cuntrolli è AsymAD è AD anu ricivutu una valutazione cognitiva standardizzata in a Clinica di Neurologia Cognitiva Emory o Goizueta ADRC. I so campioni di fluidu cerebrospinale sò stati pruvati da INNO-BIA AlzBio3 Luminex per ELISA Aβ1-42, analisi totale tau è p-tau (65). I valori ELISA sò usati per sustene a classificazione diagnostica di i sughjetti in basa di criteri di cut-off di biomarcatori AD stabiliti (66, 67). I dati demografici è diagnostichi di basa per altri diagnostichi CSF (FTD, ALS è PD) sò ancu ottenuti da Emory ADRC o istituzioni di ricerca affiliate. I metadati di casu riassuntu per questi casi Emory CSF ponu esse truvati in a Tabella S1A. E caratteristiche di a cohorte Swiss CSF replication 3 sò state publicate prima (45).
CSF hà trovu a mostra. Per aumentà a prufundità di a nostra scuperta di u settore di dati CSF, u cunsumu immune di proteine alta abbundanza hè stata realizata prima di tripsinizazione. In breve, 130 μl di CSF da 40 campioni individuali di CSF è un volume uguale (130 μl) di High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) sò stati posti in una colonna di spin (Thermo Fisher Scientific, A89868) in a stanza. température d'incubation). Dopu a filatura per 15 minuti, centrifuga a mostra à 1000 g per 2 minuti. Un filtru ultracentrifugu 3K (Millipore, UFC500396) hè statu utilizatu per cuncentrazione di l'effluent sample centrifugendu à 14 000 g per 30 minuti. Diluite tutti i volumi di mostra à 75 μl cù una soluzione salina tamponata fosfatatu. A cuncentrazione di prutezione hè stata evaluata da u metudu di l'acidu bicinchoninic (BCA) secondu u protocolu di u fabricatore (Thermo Fisher Scientific). U CSF immunodepleted (60 μl) da tutti i 40 campioni è stato digerito con lisil endopeptidasi (LysC) e tripsina. In breve, a mostra hè stata ridutta è alchilata cù 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine è 3 μl 0.8 M chloroacetamide à 90 ° C per 10 minuti, è dopu sonicated in un bagnu d'acqua per 15 minuti. U campione hè stata diluita cù 193 μl 8 M urea buffer [8 M urea è 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] à una concentrazione finale di 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) hè utilizatu per a digestioni di notte à a temperatura di l'ambienti. A mostra hè stata poi diluita à urea 1 M cù bicarbonate d'ammoniu 50 mM (ABC) (68). Aghjunghjite una quantità uguale (4,5 μg) di tripsina (Promega), è poi incubate a mostra per 12 ore. Acidificate a suluzione di peptide digerita à una cuncentrazione finale di 1% àcitu formicu (FA) è 0,1% àcitu trifluoroacetic (TFA) (66), è poi dissalate cù una colonna 50 mg Sep-Pak C18 (Waters) cum'è descrittu sopra (25) . Allora u peptide hè eluutu in 1 ml di 50% acetonitrile (ACN). Per standardizà a quantificazione di proteine in lotti (25), aliquote di 100 μl da tutti i 40 campioni di CSF sò stati cumminati per generà un campione mistu, chì hè statu divisu in cinque campioni standard internu glubale (GIS) (48). Tutti i campioni individuali è i normi cumminati sò siccati da un vacuum d'alta veloce (Labconco).
CSF copia u sample. Dayon è i culleghi anu descrittu prima l'esaurimentu immune è a digestione di i campioni di copia CSF 3 (45, 46). I campioni replicati rimanenti ùn sò micca stati immunodepleted individualmente. Digerite questi campioni micca rimossi in tripsina cum'è descrittu prima (17). Per ogni analisi ripetuta, 120 μl aliquots di u peptide elutatu da ogni campione sò stati riuniti è divisi in aliquote di uguali volumi per esse utilizati cum'è standard internu glubale marcatu TMT (48). Tutti i campioni individuali è i normi cumminati sò siccati da un vacuum d'alta veloce (Labconco). Per rinfurzà u segnu di a proteina CSF di bassa abbundanza, cumminendu 125 μl da ogni mostra, un campione "migliuratu" hè statu preparatu per ogni analisi replicata [vale à dì, una mostra biologica chì imita a mostra di ricerca, ma a quantità dispunibule hè assai più grande (37, 69)] fusionatu in un sample CSF mistu (17). A mostra mista hè stata immunoremove cù 12 ml di High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digerita cum'è descritta sopra, è inclusa in l'etichettatura TMT multipla successiva.
Tempu di post: 27-aug-2021