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I termòfili sò microrganismi chì si sviluppanu à alte temperature. Studià elli pò furnisce infurmazioni preziose nantu à cumu a vita si adatta à e cundizioni estremi. In ogni casu, hè difficiule di ottene cundizioni di alta temperatura cù microscopi ottichi cunvinziunali. Diversi suluzioni casalinghi basati nantu à u riscaldamentu elettricu resistiu lucale sò stati pruposti, ma ùn ci hè una solu suluzione cummerciale simplice. In questu articulu, intruducemu u cuncettu di riscaldamentu laser à microscale nantu à u campu di vista di u microscopiu per furnisce temperature elevate per studii termofili mantenendu l'ambiente di l'utilizatori mite. U riscaldamentu à microscala à una intensità laser moderata pò esse ottenuta utilizendu un sustrato rivestitu di nanoparticule d'oru cum'è un assorbitore di luce biocompatibile è efficiente. I pussibuli effetti di a convezione di fluidi microscale, a ritenzione di e cellule è u muvimentu termoforeticu centrifugu sò discututi. U metudu hè statu dimustratu in duie spezie: (i) Geobacillus stearothermophilus, un bacteriu termòfilu attivu chì si riproduce à circa 65 ° C, chì avemu osservatu per germinà, crescenu è natà sottu microscale heating; (ii) Thiobacillus sp., un'archea ottimamente ipertermofila. à 80 °C. Stu travagliu apre a strada per l'osservazione simplice è sicura di i microorganismi termofili utilizendu strumenti di microscopia muderni è assequibili.
Più di miliardi di anni, a vita nantu à a Terra hà evolutu per adattà à una larga gamma di cundizioni ambientali chì sò qualchì volta cunsiderate estremi da a nostra perspettiva umana. In particulare, certi microorganismi termòfili (bacteria, archaea, fungi) chjamati termòfili prosperanu in a temperatura di 45 ° C à 122 ° C1, 2, 3, 4. Termofili campanu in diversi ecosistemi, cum'è venti idrotermali di u mare profondu, surgenti termali. o zone vulcaniche. A so ricerca hà generatu assai interessu annantu à l'ultimi decennii per almenu dui motivi. Prima, pudemu amparà da elli, per esempiu, cumu i termofili 5, 6, l'enzimi 7, 8 è i membrani 9 sò stabile à una temperatura cusì alta, o cumu i termofili ponu sustene livelli estremi di radiazione10. Siconda, sò a basa per parechje applicazioni biotecnologiche impurtanti1,11,12 cum'è a pruduzzione di carburante13,14,15,16, sintesi chimica (diidro, alcooli, metanu, aminoacidi, etc.)17, biomining18 è biocatalizzatori termostabili7 ,11, 13. In particulare, a reazione in catena di polimerasi (PCR)19 cunnisciuta oghji cunnisciuta implica una enzima (Taq polimerasi) isolata da u bacteriu termofilicu Thermus aquaticus, unu di i primi termofili à esse scupertu.
Tuttavia, u studiu di i termofili ùn hè micca un compitu faciule è ùn pò micca esse improvisatu in ogni laboratoriu biologicu. In particulare, i termofili viventi ùn ponu esse osservati in vitro cù qualsiasi microscopiu di luce standard, ancu cù e camere di riscaldamentu dispunibili in u cummerciu, di solitu valutate per a temperatura di 40 ° C. Dapoi l'anni 1990, solu uni pochi di gruppi di ricerca anu dedicatu à l'intruduzioni di sistemi di microscopia à alta temperatura (HTM). In u 1994 Glukh et al. A camera di riscaldamentu / rinfrescante hè stata cuncipita nantu à l'usu di una cellula Peltier chì cuntrola a temperatura di i capillari rettangulari chjusi per mantene l'anaerobicità 20 . U dispusitivu pò esse riscaldatu finu à 100 °C à un ritmu di 2 °C/s, chì permette à l'autori di studià a motilità di a bacteria ipertermofila Thermotoga maritima21. In u 1999 Horn et al. Un dispositivu assai simili hè statu sviluppatu, sempre basatu annantu à l'usu di capillari riscaldati adattati per a microscopia cummerciale per studià a divisione / cunnessione cellulare. Dopu un longu periodu di inattività relative, a ricerca di HTMs efficaci ripigliò in 2012, in particulare in cunnessione cù una seria di documenti da u gruppu Wirth chì anu utilizatu un dispositivu inventatu da Horn et al. Quince anni fà, a motilità di un gran numaru d'archei, cumpresi ipertermofili, hè stata studiata à a temperatura finu à 100 ° C cù capillari riscaldati23,24. Anu ancu mudificatu u microscopiu originale per ottene un riscaldamentu più veloce (parechji minuti invece di 35 minuti per ghjunghje à a temperatura stabilita) è ottene un gradiente di temperatura lineale di più di 2 cm in u mediu. Stu dispusitivu di forma di gradiente di temperatura (TGFD) hè stata utilizata per studià a mobilità di parechji termofili in gradienti di temperatura à distanze biologicamente rilevanti 24, 25 .
Riscaldamentu di i capillari chjusi ùn hè micca l'unicu modu per osservà i termofili vivi. In u 2012, Kuwabara et al. E camere di Pyrex dispunibuli fatti in casa sigillate cù adesivu resistente à u calore (Super X2; Cemedine, Giappone) sò state aduprate. I campioni sò stati posti nantu à una piastra di riscaldamentu trasparente dispunibule cummerciale (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Giappone) capace di scaldà finu à 110 ° C, ma micca originariamente destinatu à bioimaging. L'autori anu osservatu una divisione efficiente di batteri termofili anaerobi (Thermosipho globiformans, duppiu tempu 24 min) à 65 ° C. In u 2020, Pulshen et al. U riscaldamentu efficiente di i piatti di metalli cummirciali (AttofluorTM, Thermofisher) hè statu dimustratu cù dui elementi riscaldanti fatti in casa: un coperchio è un palcuscenicu (configurazione inspirata da a macchina PCR). Questa associazione risulta in una temperatura di liquidu uniforme è impedisce l'evaporazione è a condensazione in u fondu di a tapa. L'usu di un O-ring evita u scambiu di gasu cù l'ambiente. Stu HTM, chjamatu Sulfoscope, hè stata utilizata per imagine Sulfolobus acidocaldarius à 75 ° C27.
Una limitazione ricunnisciuta di tutti questi sistemi era a restrizione à l'usu di l'ugettivi di l'aria, ogni immersione in l'oliu ùn era micca adattata per una temperatura cusì alta è per l'imaghjini attraversu campioni trasparenti > 1 mm di spessore. Una limitazione ricunnisciuta di tutti questi sistemi era a restrizione à l'usu di l'ugettivi di l'aria, ogni immersione in l'oliu ùn era micca adattata per una temperatura cusì alta è per l'imaghjini attraversu campioni trasparenti > 1 mm di spessore. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование возование возованих возовова ьку любое иммерсионное погружение в масло не подходило для такой высокой температужение в масло не подходило для такой высокой температуры и зари подходило зрачные образцы толщиной > 1 мм. Un difettu ricunnisciutu di tutti questi sistemi era a limitazione à l'usu di l'ugettivi di l'aria, postu chì ogni immersione in oliu ùn era micca adattatu per una temperatura cusì alta è per a visualizazione attraversu campioni trasparenti > 1 mm di spessore.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不油浸都不适堘制是限制使用空气物镜，任何油浸都不油浸都不适堘皩忙适堘皩帍适堌气物镜毫米厚的透明样品成像。 Una limitazione ricunnisciuta di tutti questi sistemi hè a limitazione di l'usu di un specchiu à l'aria, cum'è ogni immersione in oliu ùn hè micca adattatu per l'imaghjini di campioni trasparenti > 1 mm di spessore à tali temperature alte. Общепризнаным Недостатком ВСехм я Тистьчтсн ириезонсное в, Лиеектиооноте в маслеTние в маслеориона в тружерионе в маслени в маслениопрепри Годно Для Такихи воких Терату Os Визуализации черерез Преи черерез Поберерез Порирере тре Образцрачтые образцрачтй> 1 мм. Un svantaghju ricunnisciutu di tutti questi sistemi hè l'usu limitatu di lenti di l'aria, ogni immersione in oliu ùn hè micca adattatu per tali temperature elevate è a visualizazione attraversu campioni trasparenti > 1 mm di spessore.Più recentemente, sta limitazione hè stata rialzata da Charles-Orzag et al. 28, chì hà sviluppatu un dispositivu chì ùn furnisce più calore intornu à u sistema d'interessu, ma piuttostu à l'internu di u vetru di coperta stessu, coperto cù una fina capa trasparente di una resistenza fatta di ITO (ossidu d'indiu-tin). A tapa pò esse riscaldata finu à 75 ° C passendu un currente elettricu à traversu a capa trasparente. In ogni casu, l'autore deve ancu calà a lente à l'ughjettu, ma micca più di 65 ° C, per ùn dannu.
Sti travaglii mostranu chì u sviluppu di a microscopia otticu efficaci à alta temperatura ùn hè micca stata largamente aduttata, spessu esige l'equipaggiu di casa, è hè spessu ottenuta à u costu di a risoluzione spaziale, chì hè un svantaghju seriu postu chì i microorganismi termofili ùn sò micca più grande di uni pochi. micrometri. U voluminu di riscaldamentu riduttu hè a chjave per risolve trè prublemi inerenti di HTM: una scarsa risoluzione spaziale, una alta inerzia termica quandu u sistema si riscalda, è un riscaldamentu dannosu di l'elementi circundanti (oliu d'immersione, lente obiettivu ... o mani di l'utilizatori) à temperature estreme. ).
In questu documentu, introducemu un HTM per l'osservazione termofila chì ùn hè micca basatu annantu à u riscaldamentu resistivo. Invece, avemu ottenutu un riscaldamentu localizatu in una regione limitata di u campu di vista di u microscopiu per irradiazione laser di un sustrato chì assorbe a luce. A distribuzione di a temperatura hè stata visualizata cù a microscopia di fase quantitativa (QPM). L'efficacità di stu metudu hè dimustrata da Geobacillus stearothermophilus, una bacteria termofila motile chì si riproduce à circa 65 ° C è hà un cortu tempu di radduppiamentu (circa 20 minuti), è Sulfolobus shibatae, un ipertermofilu chì cresce in modu ottimale à 80 ° C (archaea). per illustrà. A rata di replicazione normale è a natazione sò stati osservati in funzione di a temperatura. Stu laser HTM (LA-HTM) ùn hè micca limitatu da u grossu di u coverslip o da a natura di l'ughjettu (immersione d'aria o d'oliu). Questu permette à qualsiasi lenti d'alta risoluzione nantu à u mercatu per esse usatu. Ùn soffre micca ancu di riscaldamentu lento per via di l'inerzia termale (ottene un riscaldamentu istantaneu nantu à una scala di millisecondi) è usa solu cumpunenti dispunibili in u cummerciu. L'unicu preoccupazione nova di sicurità sò ligati à a presenza di raggi laser putenti (tipicamenti finu à 100 mW) in u dispusitivu è possibbilmente attraversu l'ochji, chì necessitanu occhiali protettivi.
U principiu di LA-HTM hè di utilizà un laser per calà a mostra in u locu in u campu di vista di u microscope (Fig. 1a). Per fà questu, a mostra deve esse assorbenti di luce. Per utilizà una putenza laser raghjone (menu di 100 mW), ùn avemu micca cunfidendu l'absorzione di a luce da u mediu liquidu, ma hà aumentatu artificialmente l'absorption di l'esemplari di u sustrato cù nanoparticuli d'oru (Fig. 1c). Riscaldamentu di nanoparticelle d'oru cù a luce hè di primura fundamentale per u campu di a plasmonica termale, cù applicazioni previste in biomedicina, nanochimica o cugliera di u sole29,30,31. In l'ultimi anni, avemu usatu questu LA-HTM in parechji studii ligati à l'applicazioni di plasma termale in fisica, chimica è biologia. A difficultà principale cù stu metudu hè di vede u prufilu di a temperatura finale, postu chì a temperatura elevata hè limitata à una regione microscale in a mostra. Avemu dimustratu chì a mappatura di a temperatura pò esse ottenuta cù l'interferometru di cisura trasversale di quattru lunghezze d'onda, un metudu simplice, d'alta risoluzione è assai sensibile di microscopia di fase quantitativa basatu annantu à l'usu di reti di diffrazione bidimensionale (cunnisciutu ancu com'è reticoli incrociati). 33,34,35,36. L'affidabilità di sta tecnica di microscopia termale, basata nantu à a microscopia di fronti d'onda incrociati (CGM), hè stata dimustrata in una decina di documenti publicati in l'ultima decada37,38,39,40,41,42,43.
Schema di stallazione di u microscopiu di riscaldamentu laser parallelu, modellazione è temperatura. b Geometria d'esempiu custituita da una camera AttofluorTM chì cuntene una lamina coperta rivestita di nanoparticelle d'oru. c Fighjate attentamente à a mostra (micca à scala). d rapprisenta u prufilu uniforme laser fasciu è (e) a distribuzione di temperatura dopu simulata nantu à u pianu di mostra di i nanoparticuli d'oru. f hè un prufilu di fasciu laser annulare adattatu per generà una temperatura uniforme cum'è mostra in a simulazione di a distribuzione di temperatura risultatu mostrata in (g). Barre d'échelle : 30 µm.
In particulare, avemu ottenutu recentemente u riscaldamentu di e cellule di mammiferi cù LA-HTM è CGM è seguite e risposte di scossa di calore cellulare in u intervalu di 37-42 ° C, dimustrendu l'applicabilità di sta tecnica à l'imaghjini di una sola cellula viventi. In ogni casu, l'applicazione di LA-HTM à u studiu di i microorganismi à altissime temperature ùn hè micca unambiguu, postu chì esige più prudenza cumparatu cù e cellule di mammiferi: prima, riscalda u fondu di u mediu da decine di gradi (piuttostu cà uni pochi di gradi) porta. à un forte gradient de température vertical. pò creà cunvezione fluida 44 chì, s'ellu ùn hè micca fermamente attaccata à u sustrato, pò causà un muvimentu indesevule è mischjà di bacteria. Sta cunveczione pò esse eliminata da riducendu u gruixu di a capa di liquidu. Per questu scopu, in tutti l'esperimenti presentati quì sottu, i suspensii bacteriali sò stati posti trà dui coverslips apprussimatamente 15 µm di grossu posti in una tazza di metallo (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b, c). In principiu, a cunvezione pò esse evitata se u grossu di u liquidu hè più chjucu cà a dimensione di u fasciu di u laser di riscaldamentu. Siconda, travaglià in una geometria cusì limitata pò suffocate l'organisimi aerobichi (vede Fig. S2). Stu prublema pò esse evitata usendu un sustrato chì hè permeable à l'ossigenu (o qualsiasi altru gasu vitale), allughjendu i bubbles d'aria intrappulati à l'internu di u coverslip, o per drilling holes in the top coverslip (vede Fig. S1) 45 . In questu studiu, avemu sceltu l'ultima suluzione (Figure 1b è S1). Infine, u riscaldamentu laser ùn furnisce micca una distribuzione uniforme di a temperatura. Ancu à a listessa intensità di u fasciu laser (Fig. 1d), a distribuzione di a temperatura ùn hè micca uniforme, ma s'assumiglia à a distribuzione gaussiana per a diffusione termale (Fig. 1e). Quandu u scopu hè di stabilisce temperature precise in u campu di vista per studià i sistemi biologichi, i profili irregolari ùn sò micca ideali è ponu ancu guidà à u muvimentu termoforeticu di bacteria si ùn aderiscenu micca à u sustrato (vede Fig. S3, S4)39. À questu scopu, avemu usatu un modulatore di luce spaziale (SLM) per furmà u fasciu laser infrared secondu a forma di l'anellu (Fig. 1f) in u pianu di a mostra per ottene una distribuzione di temperatura perfettamente uniforme in una zona geomètrica. malgradu a diffusione termale (Fig. 1d) 39, 42, 46. Pone un top coverslip sopra un platu di metallu (Figura 1b) per evitari l'evaporazione di u mediu è osservate per almenu uni pochi di ghjorni. Perchè stu coverslip superiore ùn hè micca sigillatu, un mediu supplementu pò esse facilmente aghjuntu in ogni mumentu se ne necessariu.
Per illustrà cumu funziona LA-HTM è dimustrà a so applicabilità in a ricerca termofila, avemu studiatu a bacteria aerobica Geobacillus stearothermophilus, chì anu una temperatura ottima di crescita di circa 60-65 ° C. U bacteriu hà ancu flagella è a capacità di natà, chì furnisce un altru indicatore di l'attività cellulare normale.
I campioni (Fig. 1b) sò stati pre-incubati à 60 ° C per una ora è dopu pusatu in un supportu di mostra LA-HTM. Questa pre-incubazione hè facultativa, ma ancu utile, per dui motivi: Prima, quandu u laser hè attivatu, face chì e cellule crescenu immediatamente è si dividenu (vede u filmu M1 in Materiali Supplementari). Senza pre-incubazione, a crescita bacteriana hè tipicamente ritardata di circa 40 minuti ogni volta chì una nova zona di visualizazione hè riscaldata nantu à a mostra. Siconda, a pre-incubazione di l'ora di 1 hà prumuvutu l'adesione di i battìri à u coverslip, impediscendu chì e cellule sguassate fora di u campu di vista per via di a termoforesi quandu u laser hè stata attivata (vede a film M2 in Materiali Supplementari). A termoforesi hè u muvimentu di particelle o molécule longu un gradiente di temperatura, generalmente da u caldu à u friddu, è i batteri ùn sò micca eccezzioni43,47. Stu effettu indesevule hè eliminatu nantu à una zona determinata usendu SLM per furmà u fasciu laser è ottene una distribuzione di temperatura plana.
Nantu à fig. A figura 2 mostra a distribuzione di a temperatura misurata da CGM ottenuta da irradiate un sustrato di vetru rivestitu di nanoparticuli d'oru cù un fasciu laser annular (Fig. 1f). Una distribuzione di temperatura plana hè stata osservata nantu à tutta a zona coperta da u fasciu laser. Questa zona hè stata stabilita à 65 ° C, a temperatura ottima di crescita. Fora di sta regione, a curva di temperatura casca naturalmente à \(1/r\) (induve \(r\) hè a coordenada radiale).
una Mappa di temperatura di e misurazioni CGM ottenute utilizendu un fasciu laser annular per irradià una strata di nanoparticule d'oru per ottene un prufilu di temperatura pianu nantu à una zona circular. b Isotherme de la carte de température (a). U contornu di u fasciu laser hè rapprisintatu da un circhiu di punti grisgiu. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte (vede Materiali Supplementari, Figura S4).
A viabilità di e cellule batteriche hè stata monitorata per parechje ore cù LA-HTM. Nantu à fig. 3 mostra l'intervallu di tempu per quattru imagine pigliate da un filmu di 3 ore 20 minuti (Movie M3, Informazioni supplementari). On a observé que les bactéries proliféraient activement dans l'aire circulaire définie par le laser où la température était optimale, approchant de 65°C. In cuntrastu, a crescita cellulare hè stata significativamente ridutta quandu a temperatura hè cascata sottu à 50 ° C per 10 s.
L'imaghjini di prufundità otticu di i batteri G. stearothermophilus chì crescenu dopu à u riscaldamentu laser in tempi diversi, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, fora di 200 Estrattu da un filmu di un minutu (film M3 furnitu in l'Informazioni Supplementari) sovrapposto à a mappa di temperatura currispondente. U laser si accende à u tempu \(t=0\). L'isotermi sò stati aghjuntu à l'imaghjini di intensità.
Per quantificà più a crescita di e cellule è a so dependenza di a temperatura, avemu misuratu l'aumentu di a biomassa di diverse culunie di bacteria inizialmente isolate in u campu di vista Movie M3 (Fig. 4). I batteri parentali selezziunati à l'iniziu di a furmazione di unità formanti mini colonie (mCFU) sò mostrati in Figura S6. E misure di massa secca sò state pigliate cù una camera CGM 48 chì hè stata aduprata per cartografia a distribuzione di a temperatura. A capacità di u CGM per misurà u pesu seccu è a temperatura hè a forza di u LA-HTM. Cum'è l'aspittava, a temperatura alta hà causatu una crescita bacteriana più veloce (Fig. 4a). Cum'è mostra in u semi-log plot in Fig. 4b, a crescita à tutte e temperature segue a crescita esponenziale, induve i dati utilizanu a funzione esponenziale \(m={m}_{0}{10}^{t/\tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), induve \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) - tempu di generazione (o tempu di raddoppiu), \( g =1/ \tau\) - ritmu di crescita (numaru di divisioni per unità di tempu). Nantu à fig. 4c mostra u tassu di crescita rispettivi è u tempu di generazione in funzione di a temperatura. I mCFU di crescita rapida sò carattarizati da a saturazione di a crescita dopu à duie ore, un cumpurtamentu previstu per una alta densità bacteriana (simile à a fase stazionaria in i culturi liquidi classici). A forma generale \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) currisponde à a curva di dui fasi previsti per G. stearothermophilus cù un ritmu di crescita ottimali intornu à 60-65 ° C. Corrisponde i dati cù un mudellu cardinali (Figura S5)49 induve \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, chì cuncorda bè cù altri valori citati in a literatura49. Ancu s'è i paràmetri dipendenti di a temperatura sò riproducibili, a rata di crescita massima di \({G}_{0}\) pò varià da un esperimentu à l'altru (vede figure S7-S9 è film M4). In cuntrastu à i paràmetri di adattazione di a temperatura, chì deve esse universale, u ritmu di crescita massimu dipende da e proprietà di u mediu (disponibilità di nutrienti, cuncentrazione d'ossigenu) in a geometria microscale osservata.
a Crescita microbica à diverse temperature. mCFU: Unità di Formazione di Colonie Miniatura. Dati ottenuti da un video di una sola bacteria chì cresce in un gradiente di temperatura (movie M3). b Idem à (a), scala semi-logaritmica. c Tasso di crescita\(\tau\) è tempu di generazione\(g\) calculatu da a regressione lineare (b). Barre d'errore horizontale: intervallu di temperatura nantu à quale i mCFU s'hè allargatu in u campu di vista durante a crescita. Barre d'errore verticali: errore standard di regressione lineale.
In più di u crescita normale, certi battìri à volte flottavanu in vista durante u riscaldamentu laser, chì hè un cumpurtamentu previstu per i battìri cù flagelli. U filmu M5 in l'infurmazioni supplementari mostra tali attività di natazione. In questu esperimentu, a radiazione laser uniforme hè stata aduprata per creà un gradiente di temperatura, cum'è mostra in Figure 1d, e è S3. A Figura 5 mostra duie sequenze di l'imaghjini selezziunate da u filmu M5 chì mostranu chì un bacteriu mostra un muvimentu direzionale mentre chì tutti l'altri batteri restanu immobili.
I dui frames di tempu (a) è (b) mostranu a natazione di dui batteri diffirenti marcati cù circles puntelli. L'imaghjini sò stati estratti da u filmu M5 (furnitu cum'è materiale supplementu).
In u casu di G. stearothermophilus, u muvimentu attivu di battìri (Fig. 5) hà cuminciatu uni pochi sicondi dopu chì u fasciu laser hè stata attivata. Questa osservazione enfatizeghja a risposta tempurale di stu microorganismu termofilu à un aumentu di a temperatura, cum'è digià osservatu da Mora et al. 24 . U tema di a motilità bacteriana è ancu a termotaxis pò esse esploratu in più cù LA-HTM.
A natazione microbiana ùn deve esse cunfusa cù altri tipi di muvimentu fisicu, à dì (i) u muvimentu browniano, chì pare esse un muvimentu caòticu senza una direzzione definita, (ii) a cunvezione 50 è a termoforesi 43, cunsistenti in una deriva regulare di u muvimentu longu una temperatura. gradiente.
G. stearothermophilus hè cunnisciutu per a so capacità di pruduce spori altamente resistenti (formazione di spori) quandu espunutu à e cundizioni ambientali avversi cum'è difesa. Quandu e cundizioni ambientali tornanu favurevuli, i spori germinate, furmendu e cellule viventi è ripiglià a crescita. Ancu si stu prucessu di sporulazione / germinazione hè ben cunnisciutu, ùn hè mai statu osservatu in tempu reale. Utilizendu LA-HTM, avemu rapportu quì a prima osservazione di l'avvenimenti di germinazione in G. stearothermophilus.
Nantu à fig. 6a mostra l'imaghjini time-lapse di a prufundità ottica (OT) ottenuta cù un set CGM di 13 spore. Per tuttu u tempu di cullizzioni (15 h 6 min, \(t=0\) - l'iniziu di u riscaldamentu laser), 4 di 13 spore germinate, in punti di tempu successivi \(t=2\) h, \( 3\). ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' è \(11\) h \(30\)'. Ancu s'ellu solu unu di questi avvenimenti hè mostratu in a Figura 6, 4 avvenimenti di germinazione ponu esse osservati in u filmu M6 in u materiale supplementu. Curiosamente, a germinazione pare esse aleatoria: micca tutti i spori germinate è ùn sò micca germinate à u stessu tempu, malgradu i stessi cambiamenti in e cundizioni ambientali.
a Time-lapse custituitu di 8 images OT (immersione in oliu, 60x, 1.25 NA scopu) è (b) evoluzione biomassa di G. stearothermophilus aggregates. c (b) Disegnatu nantu à una scala semi-log per mette in risaltu a linearità di u ritmu di crescita (linea tratteggiata).
Nantu à fig. 6b,c mostra a biomassa di e pupulazioni di cellule in u campu di vista in funzione di u tempu per tuttu u periodu di raccolta di dati. A decadenza rapida di a massa secca osservata à \(t=5\)h in a fig. 6b, c, per via di a surtita di qualchi cellula da u campu di vista. U ritmu di crescita di sti quattru avvenimenti hè \(0,77\pm 0,1\) h-1. Stu valore hè più altu ch'è u ritmu di crescita assuciatu cù a Figura 3. 3 è 4, induve e cellule crescenu nurmale. U mutivu di l'aumentu di a crescita di G. stearothermophilus da i spori ùn hè micca chjaru, ma sti misurazioni mette in risaltu l'interessu di LA-HTM è u travagliu à u nivellu di una cellula unica (o à u livellu unicu mCFU) per amparà più nantu à a dinamica di a vita cellulare. .
Per dimustrà più a versatilità di LA-HTM è a so prestazione à alte temperature, avemu esaminatu a crescita di Sulfolobus shibatae, un archaea acidophilic hypertermophilic cù una temperatura ottima di crescita di 80 ° C51. Comparatu à G. stearothermophilus, sti archei anu ancu una morfologia assai diversa, chì s'assumiglia à sfere di 1 micron (cocci) in quantu à bastoni allungati (bacilli).
A figura 7a hè custituita da l'imaghjini di prufundità otticu sequenziale di S. shibatae mCFU ottenuti cù CGM (vede a film di M7 in Materiali Supplementari). Stu mCFU cresce à circa 73 ° C, sottu à a temperatura ottima di 80 ° C, ma in u intervallu di temperatura per a crescita attiva. Avemu osservatu parechji avvenimenti di fissione chì facenu chì i mCFU parevanu microrapes d'archeea dopu uni pochi ore. Da queste immagini OT, a biomassa mCFU hè stata misurata cù u tempu è presentata in Figura 7b. Curiosamente, S. shibatae mCFU dimustrava crescita lineale in quantu à a crescita esponenziale vistu cù G. stearothermophilus mCFUs. Ci hè stata una longa discussione 52 nantu à a natura di i ritmi di crescita di e cellule: mentre chì certi studii riportanu ritmi di crescita di microbi chì sò proporzionali à a so dimensione (crescita esponenziale), altri mostranu un ritmu constantu (crescita lineale o bilineare). Cum'è spiegatu da Tzur et al.53, a distinzione trà a crescita esponenziale è (bi)lineale richiede una precisione di <6% in e misurazioni di biomassa, chì hè fora di a maiò parte di e tecniche QPM, ancu chì implicanu l'interferometria. Cum'è spiegatu da Tzur et al.53, a distinzione trà a crescita esponenziale è (bi)lineale richiede una precisione di <6% in e misurazioni di biomassa, chì hè fora di a maiò parte di e tecniche QPM, ancu chì implicanu l'interferometria. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста третение 6% треточа х биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерфериромассы. Cum'è spiegatu da Zur et al.53, a distinzione trà a crescita esponenziale è (bi)lineale precisa <6% di precisione in e misurazioni di biomassa, chì hè inaccessibile per a maiò parte di i metudi QPM, ancu cù l'interferometria.Cum'è spiegatu da Zur et al. 53, a distinzione trà a crescita esponenziale è (bi)lineare richiede una precisione di menu di 6% in e misurazioni di biomassa, chì hè inaccessibile per a maiò parte di i metudi QPM, ancu quandu l'interferometria hè aduprata. CGM ottenga sta precisione cù una precisione sub-pg in misure di biomassa36,48.
a Time-lapse custituitu di 6 imaghjini OT (immersione in oliu, 60x, NA obiettivo 1.25) è (b) evoluzione di biomassa micro-CFU misurata cù CGM. Vede u filmu M7 per più infurmazione.
A crescita perfettamenti lineale di S. shibatae hè stata inespettata è ùn hè micca stata rappurtata. In ogni casu, una crescita esponenziale hè prevista, almenu perchè cù u tempu, parechje divisioni di 2, 4, 8, 16 ... cellule devenu esse. Avemu l'ipotesi chì a crescita lineale puderia esse dovuta à l'inibizione di e cellule per via di un densu imballamentu di e cellule, cum'è a crescita di e cellule rallenta è eventualmente ghjunghje à un statu di dorme quandu a densità cellulare hè troppu alta.
Cuncludemu discutendu i seguenti cinque punti d'interessu à turnu: riduzzione di u voluminu di riscaldamentu, riduzzione di l'inerzia termale, interessu in nanoparticule d'oru, interessu in a microscopia di fase quantitativa, è una pussibulità di temperatura in quale LA-HTM pò esse usata.
Paragunatu à u riscaldamentu resistive, u riscaldamentu laser utilizatu per u sviluppu HTM offre parechji vantaghji, chì illustememu in stu studiu. In particulare, in i media liquidu in u campu di vista di u microscopiu, u voluminu di riscaldamentu hè guardatu à pocu (10 μm) 3 volumi. In questu modu, solu i microbii osservati sò attivi, mentri l'altri battìri sò dorme è ponu esse utilizati per studià più a mostra - ùn ci hè bisognu di cambià a mostra ogni volta chì una nova temperatura deve esse verificata. Inoltre, u riscaldamentu à microscale permette l'esame direttu di una larga gamma di temperature: a figura 4c hè stata ottenuta da un filmu di 3 ore (Movie M3), chì generalmente richiede a preparazione è l'esaminazione di parechji campioni - unu per ognuna di i campioni studiati. y hè a temperatura chì rapprisenta u numeru di ghjorni in l'esperimentu. A riduzzione di u vulume caldu mantene ancu tutti i cumpunenti ottichi circundanti di u microscopiu, in particulare a lenti objetiva, à a temperatura di l'ambienti, chì hè statu un prublema maiò affrontatu da a cumunità finu à avà. LA-HTM pò esse usatu cù qualsiasi lenti, cumpresi lenti à immersione in oliu, è stà à a temperatura di l'ambienti ancu cù temperature estreme in u campu di vista. A limitazione principale di u metudu di riscaldamentu laser chì avemu infurmatu in stu studiu hè chì e cellule chì ùn aderiscenu micca o float ponu esse luntanu da u campu di vista è difficili di studià. Una soluzione pò esse l'usu di lenti di ingrandimentu bassu per ottene una crescita di temperatura più grande in più di uni pochi centinaie di microni. Questa prudenza hè accumpagnata da una diminuzione di a risuluzione spaziale, ma se u scopu hè di studià u muvimentu di i microorganismi, ùn hè micca necessariu una alta risoluzione spaziale.
A scala di tempu per u riscaldamentu (è u rinfrescante) u sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) dipende da a so dimensione, secondu a lege \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), induve \ (L\ ) hè a dimensione caratteristica di a fonte di calore (u diametru di u fasciu laser in u nostru studiu hè \(L\ circa 100\) μm), \(D\) hè a diffusività termica di l'ambiente (media in u nostru studiu). casu, biccheri è acqua Diffusion rate\(D\ circa 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Per quessa, in stu studiu, risposte tempu di l 'ordine di 50 ms, vale à dì, quasi-istantanea). cambiamenti di temperatura, pò esse aspittatu Stu stabilimentu istantanea di crescita temperatura ùn solu accurtà a durata di l 'esperimentu, ma permette dinù timing pricisu \(t=0\) per ogni studiu dinamica di effetti temperature.
U nostru metudu prupostu hè applicabile à qualsiasi sustrato chì assorbe a luce (per esempiu, campioni cummerciale cù revestimentu ITO). In ogni casu, i nanoparticuli d'oru sò capaci di furnisce una alta absorption in l'infrared è una bassa absorption in a gamma visibile, l'ultime caratteristiche di quale sò d'interessu per l'osservazione ottica efficace in a gamma visibile, soprattuttu quandu si usa fluorescenza. Inoltre, l'oru hè biocompatibile, chimicamente inerte, a densità ottica pò esse aghjustata da 530 nm à l'infrared vicinu, è a preparazione di mostra hè simplice è ecunomica29.
A microscopia di fronti d'onda di griglia trasversale (CGM) permette micca solu a mappatura di a temperatura à a microscala, ma ancu u monitoraghju di a biomassa, facendu particularmente utile (se micca necessariu) in cumminazione cù LA-HTM. In l'ultimi decennii, altre tecniche di microscopia di temperatura sò state sviluppate, in particulare in u campu di bioimaging, è a maiò parte di elli necessitanu l'usu di sonde fluorescenti sensibili à a temperatura54,55. In ogni casu, sti metudi sò stati criticati è certi rapporti anu misuratu cambiamenti di temperatura irrealistiche in e cellule, possibbilmente per u fattu chì a fluoriscenza dipende da parechji fatturi chì ùn sò micca a temperatura. Inoltre, a maiò parte di e sonde fluorescenti sò inestabile à alte temperature. Dunque, QPM è in particulare CGM rapprisentanu una tecnica di microscopia di temperatura ideale per studià a vita à alte temperature cù a microscopia ottica.
Studi di S. shibatae, chì campanu ottimali à 80 ° C, mostranu chì LA-HTM pò esse appiicata à studià ipertermofili, micca solu termofili simplici. In principiu, ùn ci hè micca un limitu à a gamma di temperature chì ponu esse ghjunghje cù LA-HTM, è ancu e temperature sopra i 100 ° C ponu esse ghjunte à a pressione atmosferica senza bolle, cum'è dimustratu da u nostru gruppu di 38 in applicazioni di chimica idrotermali à l'atmosfera. pressure A. Un laser hè usatu per riscalda nanoparticulate d'oru 40 in u listessu modu. Cusì, LA-HTM hà u putenziale di esse usatu per osservà ipertermofili senza precedente cù microscopia ottica standard d'alta risoluzione in cundizioni standard (vale à dì sottu stress ambientale).
Tutti l'esperimenti sò stati realizati cù un microscopiu in casa, cumprese l'illuminazione Köhler (cù LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), supportu di specimen cù u muvimentu manuale xy, obiettivi (Olympus, 60x, 0.7 NA, aria, LUCPlanFLN60X o 60x, 1.25 NA, Oil). , UPLFLN60XOI), CGM camera (QLSI cross griting, 39 µm pitch, 0.87 mm from Andor Zyla camera sensor) per furnisce intensità è imaging di fronte d'onda, è camera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modalità 16-bit, da Hamamatsu) data mostra in Figura 5 (natation bacteriana). U splitter di fasciu dicroicu hè un bordu BrightLine di 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). U filtru nantu à a fronte di a camera hè un filtru 694 passaghju curtu (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium laser sapphire (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumped tsunami laser cavity, Spectra-Physics in Fig. 2-5, rimpiazzatu ancu da Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumped Mira laser cavity, Coherent, for Fig. 2 -5). 6 è 7) sò posti à a lunghezza d'onda \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, chì currisponde à u spettru di risonanza di plasmoni di nanoparticelle d'oru. Modulatori di luce spaziali (1920 × 1152 pixel) sò stati acquistati da Meadowlark Optics L'olugrammi sò stati calculati cù l'algoritmu Gerchberg-Saxton cum'è descrittu in u ligame.
A microscopia di fronti d'onda incrociate (CGM) hè una tecnica di microscopia ottica basata nantu à a cumminazione di una rete di diffrazione bidimensionale (cunnisciutu ancu cum'è reticulu incruciatu) à una distanza di un millimetru da u sensoru di una camera convenzionale. L'esempiu più cumuni di un CGM chì avemu usatu in stu studiu hè chjamatu interferometru di shift trasversale (QLSI) di quattru lunghezze d'onda, induve u cross-grating hè custituitu da un mudellu di scacchiera di intensità / fase introduttu è patentatu da Primot et al. in 200034. I linii di griglia verticale è horizontale creanu ombre grid-like in u sensoru, a distorsione di quale pò esse processata numericamente in tempu reale per ottene a distorsione di u front d'onda otticu (o un prufilu di fase equivalente) di a luce incidente. Quandu s'utilice nantu à un microscopiu, una camera CGM pò visualizà a diferenza di u percorsu otticu di un oggettu imaginatu, cunnisciutu ancu a prufundità ottica (OT), cù una sensibilità di l'ordine di nanometri36. In ogni misurazione CGM, per eliminà qualsiasi difetti in i cumpunenti ottichi o fasci, una maghjina OT di riferimentu primariu deve esse pigliata è sottratta da qualsiasi imagine sussegwenti.
A microscopia di a temperatura hè stata realizata cù una camera CGM cum'è descritta in a riferenza. 32. In cortu, riscalda un liquidu cambia u so indice di refractive, creendu un effettu di lente termale chì distorte u fasciu incidente. Questa distorsione di u front d'onda hè misurata da a CGM è trattata cù un algoritmu di deconvoluzione per ottene una distribuzione di temperatura tridimensionale in u mediu liquidu. Se i nanoparticuli d'oru sò distribuiti uniformemente in tutta a mostra, a mappatura di a temperatura pò esse fatta in spazii senza bacteria per pruduce l'imaghjini megliu, chì hè ciò chì avemu qualchì volta. L'imaghjini di CGM di riferimentu hè stata acquistata senza riscaldamentu (cù u laser off) è dopu catturatu in u stessu locu in l'imaghjini cù u laser nantu.
A misurazione di a massa secca hè ottenuta utilizendu a stessa camera CGM utilizata per l'imaghjini di a temperatura. L'imaghjini di riferimentu CGM sò stati ottenuti movendu rapidamente a mostra in x è y durante l'esposizione cum'è un mezzu di mediu di ogni inhomogeneità in l'OT per a presenza di battìri. Da l'imaghjini OT di batteri, a so biomassa hè stata ottenuta utilizendu un inseme d'imaghjini nantu à e zone scelte cù l'algoritmu di segmentazione casalinga di Matlab (vede a subsezione "Codice numericu"), seguitu a prucedura descritta in ref. 48. In cortu, usemu a relazione \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), induve \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) hè l'immagine di prufundità ottica, \(m\) hè u pesu seccu è \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) hè una constante. Avemu sceltu \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, chì hè una constante tipica per e cellule viventi.
Una lammella di 25 mm di diametru è 150 µm di spessore rivestita di nanoparticelle d'oru hè stata piazzata in una camera AttofluorTM (Thermofisher) cù e nanoparticule d'oru rivolte in sopra. Geobacillus stearothermophilus hè stata precultivata per a notte in LB medium (200 rpm, 60 ° C) prima di ogni ghjornu di esperimenti. Una goccia di 5 µl di una sospensjoni di G. stearothermophilus cù una densità ottica (OD) di 0,3 à 0,5 hè stata posta nantu à una coperta cù nanoparticuli d'oru. Allora, una coperta tonda di 18 mm di diametru cù un pirtusu di 5 mm di diametru in u centru hè stata abbandunata nantu à a goccia, è 5 μl di suspensione bacteriana cù a listessa densità ottica hè stata ripetutamente appiicata à u centru di u pirtusu. I pozzi nantu à i coperti sò stati preparati in cunfurmità cù a prucedura descritta in ref. 45 (vede Informazioni supplementari per più infurmazione). Allora aghjunghje 1 ml di LB medium à u coverslip per impedisce chì a capa di liquidu si secca. L'ultima coperta hè posta nantu à a tapa chjusa di a camera Attofluor™ per impedisce l'evaporazione di u mediu durante l'incubazione. Per l'esperimenti di germinazione, avemu usatu spori, chì, dopu l'esperimenti cunvinziunali, volte copre u top coverslip. Un metudu simili hè stata utilizata per ottene Sulfolobus shibatae. Trè ghjorni (200 rpm, 75 ° C) di cultivazioni preliminari di Thiobacillus serrata sò stati realizati in medium 182 (DSMZ).
Campioni di nanoparticelle d'oru sò stati preparati da litografia di copolimeri di blocchi micellari. Stu prucessu hè descrittu in detail in Cap. 60. In breve, i micelli chì incapsulate ioni d'oru sò stati sintetizzati mischjendu u copolimeru cù HAuCl4 in toluene. I coverslips puliti sò stati immersi in a suluzione è trattatu cù l'irradiazione UV in a presenza di un agentu riduzzione per ottene sementi d'oru. Infine, i graneddi d'oru sò stati cultivati cuntattendu una coperta cù una suluzione acquosa di KAuCl4 è etanolamina per 16 minuti, chì hà risultatu in un arrangiamentu quasi-periodicu è assai uniforme di nanoparticulate d'oru non sferiche in l'infrared vicinu.
Per cunvertisce l'interferogrammi à l'imaghjini OT, avemu usatu un algoritmu casanu, cum'è detallatu in u ligame. 33 è hè dispunibule cum'è un pacchettu Matlab in u seguente repository publicu: https://github.com/baffou/CGMprocess. U pacchettu pò calculà l'intensità è l'imaghjini OT basatu nantu à interferogrammi registrati (cumprese l'imaghjini di riferimentu) è distanze di l'array di càmera.
Per calculà u mudellu di fasi applicatu à SLM per ottene un prufilu di temperatura determinatu, avemu usatu un algoritmu casalingu sviluppatu previamente39,42 chì hè dispunibule in u seguente repository publicu: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. L'input hè u campu di temperatura desideratu, chì pò esse stabilitu digitale o via una maghjina bmp monocroma.
Per segmentà e cellule è misurà u so pesu seccu, avemu usatu u nostru algoritmu Matlab publicatu in u seguente repository publicu: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. In ogni imagine, l'utilizatore deve cliccà nantu à a bacteria o mCFU d'interessu, aghjustà a sensibilità di a bacchetta, è cunfirmà a selezzione.
Per più infurmazione nantu à u disignu di studiu, vede l'abstrattu di u Rapportu di Ricerca di Natura ligata à questu articulu.
I dati chì sustenenu i risultati di stu studiu sò dispunibuli da i rispettivi autori nantu à una dumanda ragionevule.
U codice fonte utilizatu in stu studiu hè detallatu in a seccione Methods, è e versioni di debug ponu esse scaricate da https://github.com/baffou/ in i seguenti repositori: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, è CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight in termofili è e so applicazioni à spettru largu. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight in termofili è e so applicazioni à spettru largu.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. è Sharma, AK Overview of thermophiles è a so larga applicazione. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. è Sharma AK Una profonda cunniscenza di i termofili è una larga gamma di applicazioni.3 Biotecnologia 6, 81 (2016).
Tempu di pubblicazione: 26-sep-2022